Grunnleggende teknologier for produksjon av DNA-mikrobrikker. Biologiske mikrobrikker DNA-brikker

Nylig har DNA-teknologier blitt aktivt utviklet, som gjør det mulig ikke bare å bestemme en egenskap, men også å samtidig utføre differensiell sekvensering, dvs. bestemmelse av punktmutasjoner eller polymorfismer i kjente områder av genomet. Disse teknologiene har betydelige fordeler i forhold til tradisjonelle molekylærbiologiske metoder, fordi de gjør det mulig å miniatyrisere testprøven og analysatoren, noe som betydelig reduserer kostnadene for analyse og dens tid, samt bestemmer samtidig ulike parametere for testprøven, uten å miste følsomheten til amplifikasjonsmetoder. Hovedfordelen med metoder basert på bruk av sjetonger med oligonukleotider av alle mulige nukleotidsekvenser av en gitt lengde er deres allsidighet. Tilstedeværelsen av et oligonukleotid av en hvilken som helst sekvens på brikken gjør det mulig å analysere enhver sekvens som studeres. Bruken av mikrobrikker er basert på prinsippet om raskt å bestemme interaksjonene mellom visse ligander med mange forskjellige prober samtidig. Faktisk er biologiske mikrobrikker en eller annen fast bærer som påføres enten visse fragmenter av nukleinsyrer, eller proteiner, eller karbohydrater, eller andre probemolekyler som kan gjenkjennes eller utvise biologisk aktivitet. Antall forskjellige sonder på et underlag kan nå hundretusenvis, og brikker av hver type er strengt tatt identiske og eksisterende teknologier kan replikeres i hundretusener og millioner av kopier avsatt på et underlag.

DNA mikroarrayer

Det er protein, DNA, karbohydrater og vevschips. Spesiell oppmerksomhet fortjener DNA-brikker. De representerer et unikt analytisk verktøy som lar deg bestemme tilstedeværelsen av spesifiserte DNA-sekvenser i en analysert prøve (vanligvis av biologisk opprinnelse) (såkalt hybridiseringsanalyse). Å utføre analyser ved hjelp av DNA-brikker er flere ganger billigere enn å bruke alternative teknologier (elektroforese, sanntids PCR) og tillater med en enkel detektor arbeid utenfor laboratoriet.

DNA-brikker ble først brukt i forskning på slutten av 80-tallet av forrige århundre. Denne nå utbredte metoden, som tillater samtidig analyse av ekspresjonen av mange gener, er basert på prinsippet om gjenkjennelse av mRNA- eller cDNA-mål gjennom deres hybridisering med enkelttrådede DNA-fragmenter immobilisert på en mikrobrikke.

En DNA-brikke er en solid bærer som enkelttrådede DNA-fragmenter av forskjellig lengde immobiliseres på (vanligvis kovalent): korte - 15-25 nukleotider, lange - 25-60 nukleotider og cDNA-fragmenter - fra 100 til 3000 nukleotider. Glass, silisium, forskjellige polymerer, hydrogeler (for eksempel basert på polyakrylamid) og til og med gull brukes som substratmaterialer.

Hybridisering er grunnlaget for teknologi

Grunnlaget for alt moderne DNA-teknologi– hybridisering. Som et resultat av hybridisering er nukleinsyremolekyler i stand til å danne stabile dobbelttrådete strukturer på grunn av bindingene mellom elementene i molekylene - nukleotider. Nukleotidet adenin (A) er komplementært til tymin (T), guanin (G) er komplementært til cytosin (C). Som et resultat vil den enkelttrådede nukleotidsekvensen ATGC danne en stabil assosiasjon, en dobbelttrådet struktur, med et enkelttrådet DNA-molekyl av sammensetningen TACG.

….. ATGC….

| | | |

….. TACG….

Slik komplementaritet fører til at to DNA-molekyler "klebes sammen", hvorav det ene kan festes fast på underlaget og danne et element i DNA-brikken. Jo flere molekyler som er komplementære til elementene i brikken er inneholdt i prøven, jo flere av dem vil binde seg til brikken, og jo høyere vil intensiteten til signalet som oppfattes fra dette elementet være. I fig. Figur 1 viser prinsippet for drift av en DNA-celle eller oligonukleotid-biochip, basert på komplementære interaksjoner av adeninbasen ( EN) med tymin ( T) og guanin ( G) med cytosin ( MED) i to DNA-tråder. Hvis sekvensen av baser i en DNA-streng (eller oligonukleotid) er fullstendig komplementær til sekvensen til den andre strengen, dannes en stabil perfekt dobbelttrådet helix - en dupleks. Men tilstedeværelsen av til og med ett feil par i dupleksen, for eksempel G-G, forhindrer dupleksdannelse. Hvis du immobiliserer spesifikt enkelttrådet DNA eller for eksempel et 20-mer oligonukleotid (probe) i et av mikrobrikkeelementene, så når DNA-fragmenter merket med fluorescerende fargestoffer, for eksempel det menneskelige genomet, legges til mikrobrikken, vil deres sterkt spesifikk interaksjon vil skje. Et gitt oligonukleotidelement i en biochip vil spesifikt binde kun én komplementær sekvens av 420 =1,09x1012 av alle mulige sekvenser av denne lengden i DNA. Som et resultat observeres fluorescerende glød bare på dette komplementære elementet i biochipen. Dermed produserer ett element av en biochip en prøve fra omtrent en billion mulige alternativer, i motsetning til et element i en elektronisk brikke, der binær prøvetaking forekommer: JA eller NEI.

Ris. 1. Skjema for dannelsen av en DNA-dobbelhelix på en biochip. Oligonukleotidet er fiksert på et av elementene i biobrikken og binder selektivt kun det komplementære fra mange fluorescensmerkede DNA-fragmenter. Som et resultat begynner bare dette elementet å gløde. Dette skjer på grunn av svært spesifikke interaksjoner av komplementære nukleotidpar EN Med T Og G Med MED. Tilstedeværelsen av et ikke-komplementært par, f.eks. G-G, forhindrer interaksjon og etterlater mikrobrikkeelementet mørkt.

Enheter som brukes til å bestemme hybridiseringsparametere tillater registrering av ikke bare det endelige resultatet, men også kinetikken for assosiasjon og dissosiasjon av komplementære kjeder. Disse teknologiene, ved å muliggjøre multiparameteranalyse av prøver, kan gi en stor mengde informasjon. Resultatene av hybridisering avhenger av lengden på DNA-prøven, kjemisk oppbygning merket mål-DNA, temperatur som hybridisering utføres ved, sammensetning av hybridiseringsblandingen, type fluorescerende merke. Det skal her bemerkes at DNA-brikker hovedsakelig bruker passiv hybridisering, dvs. interaksjonen mellom mål-DNA og en immobilisert prøve er en sannsynlig prosess og avhenger av ulike forhold.

Anvendelser av DNA-brikker

Å vurdere tilstanden og identifisere alle genene til organismen som studeres er en av de viktigste oppgavene for utviklerne av DNA-brikker. Løsningen på dette problemet kan realiseres i immobilisering av alle gener i kroppen på en biologisk brikke, som vil tillate en omfattende vurdering av tilstanden til genene og genomet som helhet. Biogenetiske databaser som inneholder all informasjon (systematisert) om gener og genom ulike organismer, presenterer forskere med enorme muligheter innen DNA-brikkedesign.

Hovedårsakene til den utbredte bruken av biochipforskning inkluderer høy sensitivitet, spesifisitet og reproduserbarhet, enkelhet i implementeringsprosedyren, muligheten for samtidig analyse av mange parametere og relativt lave arbeidskostnader. De samme grunnene får oss til å betrakte biobrikker som et lovende verktøy på ulike områder av den nasjonale økonomien.

For å oppsummere, bør det bemerkes at mikroarrayer er en effektiv tilnærming for samtidig identifikasjon av titusenvis til tusenvis av gener og deres struktur analyse, for å identifisere spesifikke nukleotidsekvenser og nukleotidvariasjoner i deres struktur. Imidlertid, når gener er tilstede i genomet i mengden av en eller flere kopier, som stadig påtreffes i klinisk praksis, er deres foreløpige amplifikasjon nødvendig. Den mest effektive metoden for DNA-amplifisering er polymerasekjedereaksjonen, hvor det er en eksponentiell økning i antall DNA-molekyler fra flere til millioner eller flere kopier, og hovedfordelen med denne typen PCR, slik som sanntid, tillater selv en kvantitativ vurdering av matrisen som studeres. Dette er viktig for å løse problemer i utviklingen av grunnleggende og integrerte vitenskaper, samt optimalisere betingelsene for diagnostiske metoder.

Så to metoder som allerede har blitt tradisjonelle for noen områder av vitenskap og anvendt teknologi, sammen med deres ulemper, har helt unike fordeler.

Sanntids PCR:

· gjør det mulig å estimere mengden av den opprinnelige matrisen;

· krever ikke ekstra arbeidskrevende arbeidstrinn;

· fraværet av et elektroforesestadium tillater oss å minimere risikoen for kontaminering og dermed redusere antallet falske positive resultater;

· bruken av matematiske analysemetoder muliggjør automatisk tolkning av de oppnådde resultatene og eliminerer problemet med subjektiv vurdering av elektroferogrammer;

· gir mindre strenge krav til organisering av PCR-laboratoriet og automatisk registrering og tolkning av resultater;

· lar deg spare tid.

Biologiske mikrobrikker:

· tillate miniatyrisering av prøven og analysatoren;

· sparer tid og kostnader ved analyse;

· lar deg bestemme flere parametere av testprøven samtidig;

· har høy sensitivitet for amplifikasjonsmetoder, spesifisitet og reproduserbarhet;

· Sikrer enkelhet i arbeidsprosedyren.

Det er mulig at kombinasjonen av disse metodene ved å konvertere polymerasekjedereaksjonen til et mikrobrikkeformat vil gjøre det mulig å lage en ny generasjon diagnostisk system, som vil være preget av følgende kvaliteter: høyere sensitivitet og hovedsakelig spesifisitet for bestemmelsen. av nukleinsyrer, høy produktivitet til lave analysekostnader, generelt redusert antall manipulasjoner innenfor hvert analysetrinn.

Biologiske mikrobrikker (biobrikker), eller, som de oftere kalles, mikromatriser, er et av de nyeste verktøyene innen biologi og medisin i det 21. århundre.

Introduksjon

Biochips ble oppfunnet på slutten av 90-tallet i Russland og USA. Mikrochipteknologi er et fundamentalt nytt nivå laboratorieforskning, da det tillater samtidig testing av tusenvis av prøver. Tusenvis av DNA- eller proteinmolekyler plasseres på glassplater for å lage henholdsvis DNA og proteinbrikker. Basert på eksperimentelle data, ansatte ved Laboratory of Cell Engineering under ledelse av Dr. Sc. Beletsky I.P Institute of Theoretical and Experimental Biophysics (Pushchino, Moskva-regionen) utviklet en teknologi for storskala produksjon av glasssubstrater i produksjon av DNA-brikker, samt deres bruk i DNA-hybridiseringsanalyse. Den er basert på bruk av komplementær nukleotidbinding. Biochips brukes til en rekke formål. I medisin hjelper biochips med å oppdage legemiddelresistente former for tuberkulose og leukemi, samt enkelte typer kreft, hos pasienter i løpet av få timer. Biochips er et uunnværlig verktøy for biologer som umiddelbart, i ett eksperiment, kan se påvirkningen av ulike faktorer (medisiner, proteiner, ernæring) på funksjonen til titusenvis av gener.

Biokjemiske mikrobrikker

Biokjemiske mikrobrikker, hvis produksjons- og implementeringsteknologier utvikler seg aktivt i Russland og i utlandet, er de sterkeste eksisterende verktøyene for påvisning og identifisering av biologiske materialer. Bruken av mikrobrikker er basert på prinsippet om raskt å bestemme interaksjonene mellom visse ligander med mange forskjellige prober samtidig. Faktisk er biologiske mikrobrikker en eller annen fast bærer som påføres enten visse fragmenter av nukleinsyrer, eller proteiner, eller karbohydrater, eller andre probemolekyler som kan gjenkjennes eller utvise biologisk aktivitet. Antallet forskjellige prober på et substrat kan nå hundretusenvis, og brikker av hver type er strengt tatt identiske og kan, med eksisterende teknologi, replikeres i hundretusener og millioner av kopier avsatt på et substrat.

Hovedårsakene til den utbredte bruken av biochip-studier inkluderer høy sensitivitet, spesifisitet og reproduserbarhet, enkelhet i implementeringsprosedyren, muligheten for samtidig analyse av mange parametere og relativt lave arbeidskostnader. De samme grunnene tvinger oss til å betrakte biochips som et lovende verktøy på ulike områder av den nasjonale økonomien. Biochips brukes til å oppdage bakteriell og viral forurensning i mat, kosmetikk og miljø, påvisning av genmodifiserte organismer i matvarer, diagnostisering og prediksjon av ulike sykdommer, påvisning av spesielt farlige smittestoffer for anti-bioterrorismeformål mv.

DNA mikroarrayer

DNA-brikker er et unikt analytisk verktøy som lar deg bestemme tilstedeværelsen av spesifiserte DNA-sekvenser i en analysert prøve (vanligvis av biologisk opprinnelse) (såkalt hybridiseringsanalyse). Å utføre analyser ved hjelp av DNA-brikker er flere ganger billigere enn å bruke alternative teknologier (elektroforese, sanntids PCR) og tillater med en enkel detektor arbeid utenfor laboratoriet.

DNA-brikker ble først brukt i forskning på slutten av 80-tallet av forrige århundre. Denne nå utbredte metoden, som tillater samtidig analyse av ekspresjonen av mange gener, er basert på prinsippet om gjenkjennelse av mRNA- eller cDNA-mål gjennom deres hybridisering med enkelttrådede DNA-fragmenter immobilisert på en mikrobrikke.

En DNA-brikke er en solid bærer som enkelttrådede DNA-fragmenter av forskjellig lengde immobiliseres på (vanligvis kovalent): korte - 15-25 nukleotider, lange - 25-60 nukleotider og cDNA-fragmenter - fra 100 til 3000 nukleotider. Glass, silisium, forskjellige polymerer, hydrogeler (for eksempel basert på polyakrylamid) og til og med gull brukes som substratmaterialer. De vanligste underlagene er laget av glass.

Protein- og peptidchips

For å analysere produktene av gentranslasjon brukes sjetonger bygget på basis av polypeptider. De fleste legemiddelmålene er proteiner, og derfor kan protein- og peptidbrikker være nyttige for legemiddeloppdagelse. Proteinmikrobrikker kan være ekstremt nyttige i medisin som miniatyranalytiske systemer for å bestemme kroppens immunstatus, oppdage allergisk sensibilisering og identifisere spesifikke allergener. Mikrobrikker, som representerer en samling av de viktigste antigenene til de viktigste patogene organismene (bakterier, sopp og virus), gjør det mulig å analysere blodprøver for tilstedeværelsen av hundrevis og tusenvis av antistoffer samtidig og raskt identifisere infeksjoner stor betydning i utviklingen av proteinmikrochips. Disse inkluderer: den aller første kjente metoden - RIA (radioimmunoassay), som bruker en radioaktiv etikett, immunoanalyse ved bruk av fluorescerende etiketter - FIA og enzym-linked immunosorbent assay (ELISA), der etiketten er et enzymmolekyl kovalent koblet til et antistoffmolekyl . Svært aktive stabile enzymer (alkalisk fosfatase, peroksidase, etc.) velges som markører i ELISA. Fordelen med ELISA er muligheten for multippel signalforsterkning. I i fjor Det er utviklet følsomme substratsystemer som produserer uløselige fluorescerende produkter, for eksempel ELF-97. Åpenbart må prosessen med å produsere en proteinmikrochip inkludere prosedyren for fiksering og immobilisering på mikrobrikken. Valget av metode bestemmes av mange parametere - arten av det opprinnelige substratet, det påfølgende bruksområdet for mikrobrikken, etc. Proteinmikrochips brukes aktivt, først og fremst, for analyse av alle kjente (og tilgjengelige) biologiske væsker, inkludert blodserum/plasma, urin, cerebrospinalvæske, spytt, tårevæske, fostervann, etc.

Karbohydratmikrochips

Mange naturlige biomolekyler (proteiner, lipider) er modifisert med sukkerrester. Ofte involverer biologiske prosesser binding av sukker til reseptorer, og mikroarrayer kan være et viktig verktøy for å studere slike interaksjoner. Glykolipider støttet på nitrocellulose eller polyvinylidenfluorid er et eksempel på karbohydratmikrochips. Disse glykolipidene interagerer med proteiner med kjent karbohydratbindende spesifisitet for å bekrefte forutsagte oligosakkarid-protein-interaksjoner. Bindingen av karbohydrater til membraner detekteres ved bruk av fluorescensmerkede glykolipider. Karbohydratsammensetningen til den bundne komponenten bestemmes in situ ved massespektrometri. Det er viktig å merke seg at lipidassosierte oligosakkarider kan være av forskjellig opprinnelse, slik som glykoproteiner, proteoglykaner, glykolipider, hele celler og syntetiske oligosakkarider. Ved interaksjon av oligosakkarider hvis sekvens er kjent med membranen, kan spesifikke sukkerassosierte proteinmotiver identifiseres. Omvendt, ved å binde ukjente oligosakkarider til membranen, kan proteiner med kjente strukturer velges for å bestemme hvilke oligosakkarider de er bundet til.

Vevsmikrochips

Data fra genekspresjonsanalyse har så vidt begynt å gi oss viktig informasjon om den biologiske funksjonen til gener, deres potensielle kliniske påvirkning eller deres egnethet som legemiddelmål. Samtidig krever tradisjonell histologisk analyse av vevsprøver mye tid: vev holdes i formaldehyd, plasseres i parafin, snitt lages, og først da farges de og analyseres mikroskopisk på individuelle lysbilder. I 1998 ble vevsmikrobrikker først produsert for slik analyse ved å deponere mange vevsprøver på et enkelt substrat.

Å lage en mikrobrikke innebærer å kombinere opptil tusen nålebiopsier tatt fra parafininnstøpte vevsprøver til en parafinblokk med spesifikke koordinater. Opptil 300 seksjoner er laget av denne blokken, som overføres til glass for farging og analyse. Dermed kan opptil 300 tusen analyser utføres fra en blokk. Denne metoden forårsaker minimal vevsskade.

Når de er forberedt, kan mikroarrayer testes for interaksjon med en rekke molekylære mål – DNA, RNA eller proteiner – i hundrevis eller til og med tusenvis av vevsprøver. Den grunnleggende forskjellen mellom vevsbrikker og for eksempel DNA-brikker er at i sistnevnte tilfelle bestemmes ekspresjonen av tusenvis av gener i ett vev/prøve, mens i det førstnevnte bestemmes ett gen i tusen forskjellige vev/prøver. Fordelen med vevsmikroarray-analyse er at alle vevsprøver behandles på samme måte, dvs. reagenskonsentrasjoner, inkubasjonstid, temperatur og sammensetning av løsninger er uendret. Dessuten krever analysen bare tideler eller hundredeler av en milliliter reagenser.

Vevsmikrochips brukes ganske aktivt til å søke etter markører assosiert med visse sykdommer, først og fremst kreft. Eksempler på vellykket bruk av vevschips for analyse av autoimmune sykdommer, hjertesvikt, diabetes og nevrodegenerative patologier er vist.

Prosedyre for DNA-analyse ved bruk av biobrikker

En oligonukleotidprobe modifisert med en fosfatgruppe i 5-enden ble tverrbundet til glasset ved bruk av et kondenseringsmiddel (karbodiimid i nærvær av imidazol). Deretter ble hybridisering utført med et oligonukleotidfragment merket med biotin og en fargeperoksidasereaksjon ved bruk av et streptavidin-peroksidasekonjugat. Resultatet av analysen ble bedømt ut fra fargeintensiteten til det oksiderte substratet, dimetylaminobenzidin (DAB).

Produksjon av biologiske chips

Basert på eksperimentelle data ble det utviklet en teknologi for storskala produksjon av glasssubstrater for produksjon av DNA-brikker. For utbredt bruk av brikketeknologier, enkle, billige og effektive metoder storskala fabrikasjon og kontroll av modifiserte substrater som inneholder overflateamingrupper De mest brukte faste substratene for mikrobrikkefremstilling er glass behandlet med forskjellige aminoalkyltrialkoksysilaner, slik som APTES (3-aminopropyltrietoksysilan, fig. 3) for å oppnå en modifisert overflate.

Fig. 3 Strukturformel for APTES. a-in gratis stand, brukt-modifisert på glass

Denne overflaten er hydrofob og tillater påføring av prober med maksimal tetthet. Som det følger av litteraturdataene, kan betingelsene for å oppnå et aminomodifisert glasssubstrat være svært forskjellige. Dette gjelder både konsentrasjonen av APTES og valg av løsemiddel, som igjen kan inneholde varierende mengder vann. For å produsere aminmodifiserte substrater i stor skala, er det ønskelig å bruke løsemidler som er så lite giftige og billige som mulig, som aceton og etanol. Det har vist seg at naturen til det organiske løsningsmidlet praktisk talt ikke har noen effekt på kvaliteten til de resulterende glassene. Aktivering av nukleinsyrer utføres ved bruk av karbodiimider (CDI) - dette er en av tidlige metoder oppnå affinitetssorbenter, noe som fortsatt er ganske vanlig. Metoden er basert på karbodiimiders evne til å aktivere den terminale fosfatgruppen av nukleinsyrer. Karbodiimid-aktiverte oligonukleotider reagerer lett med amino- eller sulfhydrylgruppene til bærerne. Til dags dato har mekanismen for aktivering av fosfatgrupper av oligonukleotider med karbodiimider blitt studert i tilstrekkelig detalj. Det hastighetsbegrensende trinnet i reaksjonen er protonering av karbodiimider med dannelse av intermediære ustabile reaktive O-fosforylisoureas. Tilstrekkelig sterke nukleofile grupper av bæreren kan hemme dette trinnet

I tillegg er protonerte nukleofile grupper ikke i stand til å reagere med forbindelsene 1 [fig 4]. Som et resultat kan utbyttet av sluttprodukt 2 ved bruk av polymerer med svært basiske grupper reduseres. Substituerte O-fosforylisourea 3 kan også transformeres til biprodukter, for eksempel hydrolyseres for å frigjøre den opprinnelige fosfatgruppen og urea, eller gjennomgå en serie sekvensielle transformasjoner med dannelse av pyrofosfater, polyfosfater og O-fosforylisourea-derivater. Sistnevnte kan på sin side gi ikke-reaktive derivater av N-pyrofosforylurea 3 eller N-fosforylurea 4.

For å øke effektiviteten av nukleotidimmobilisering på polymeren utføres aktivering med karbodiimider i nærvær av en nukleofil katalysator, imidazol, som danner det tilsvarende oligonukleotidfosfamidet, som etter protonering av azolrestene er en svært reaktiv forbindelse mht. til nukleofiler. Fosfoimidazolider 5 oppnås oftest (fig. 5)

Fordelen med denne tilnærmingen er fraværet av en serie bivirkninger, siden derivat 5 er mer stabilt enn O-fosforylurea 1. Forbindelse 5 interagerer mer effektivt med aminogruppen til bæreren, noe som øker utbyttet under immobilisering.

Gjennomføre hybridisering.

Hybridiseringsanalysen er basert på bruk av komplementær nukleotidbinding (fig. 6b). For tiden kjente reaksjoner kan deles inn i to store grupper. Den første gruppen av metoder er basert på amplifikasjon - syklisk gjentakelse av in vitro-replikasjon av det ønskede DNA-fragmentet (RNA). Det amplifiserte fragmentet detekteres deretter ved gelelektroforese. Den andre gruppen inkluderer metoder for direkte deteksjon av en spesifikk nukleotidsekvens (DNA eller RNA) ved bruk av korte enkelttrådede oligonukleotidfragmenter med en reportergruppe (probe). Disse reaksjonene kalles DNA-sondering. Deres følsomhet avhenger av typen sonde som brukes og kan være svært høy. Den vanligste ikke-radioaktive reportergruppen inkludert i oligo- og polynukleotidprober er vitamin biotin (en naturlig kofaktor av en gruppe enzymer - karboksylaser) (fig. 6, A)

Ris. 6 Skjema for hybridiseringsanalysemetoden ved bruk av eksemplet på identifikasjon av genmodifiserte kilder av planteopprinnelse. A – PCR ved bruk av biotinmerkede primere - indeks (mb); B - hybridisering av PCR-produkter med spesifikke oligonukleotider immobilisert på en biologisk mikrobrikke - indeks (i)

Det biotinylerte derivatet av dUTP (bio-UTP) er inkludert i kjedene som dannes av DNA-polymeraser i stedet for tymin og er i stand til komplementære interaksjoner med adenin.

Biotin er en forbindelse som er motstandsdyktig mot høye temperaturer, til sure og alkaliske miljøer, løselig i vann og alkohol. Det er et koenzym i mange tilleggsreaksjoner (karboksyleringsreaksjoner). Biotin kan lett danne en stabil forbindelse med ulike proteiner, inkludert enzymer og immunglobuliner. Biotin finnes i store mengder i fugleegghviter, hvor det er assosiert med glykoproteinet avidin, som har en molekylvekt på 68 kDa. Biotin har ekstremt høy affinitet for avidin, så vel som for sin bakterieanalog - streptavidin (dissosiasjonskonstant for biotin-avidin-komplekset er 10-15 M) og danner et ekstremt stabilt kompleks (KA = 10 til 15. potens per mol til minus 1. potens).

Peroksidase-reaksjon

For å utføre peroksidasereaksjonen brukes et konjugat bestående av et enzym assosiert med streptavidin. Dette konjugatet danner et veldig sterkt biotin-streptavidin-kompleks, som brukes som en forbindelsesbro mellom DNA-dupleksen som dannes under hybridisering og enzymmerket.

Det mest brukte enzymmerket er pepperrotperoksidase, som først ble brukt av Nakane og Pierce. Ett enzymmolekyl konjugert til streptavidin er i stand til å "behandle" et stort antall substratmolekyler. Under påvirkning av peroksidase danner substratet H2O2 et brunt kompleks, uløselig i vann og alkohol, med fargestoffet diaminobenzidin (DAB), som akkumuleres rundt den fikserte dupleksen.

Behandling av analyseresultater

Visualisering av hybridiseringsmønsteret på en biologisk mikrobrikke for den analyserte prøven utføres ved å bruke maskinvare-programvarekomplekset for analyse av biologiske mikrobrikker "EuroBioWto Biocontrol" og dataprogrammet "MedGen". Hybridiseringsmønsteret oppnådd på dataskjermen for den analyserte prøven sammenlignes med hybridiseringsmønsteret for den positive kontrollen (kjent transgent DNA) og hybridiseringsmønsteret for den negative kontrollen (kjent ikke-transgent DNA). Et eksempel på et diagram av hybridiseringsmønsteret til en biologisk mikrobrikke er vist i fig. 9.

Ris. 9 Eksempel på et biologisk mikrobrikkeskjema for identifisering av genmodifiserte kilder av planteopprinnelse, PC-positiv kontroll, NC-negativ kontroll, Lect-soyaproteingen, Zein-maisproteingen, Gus, Nos, 35s, Npt, Ocs transgene sekvenser.

Tilstedeværelsen av lys spesifikk farging av den biologiske mikrobrikken i områder som inneholder immobiliseringsoligonukleotider (for 35S- og Nos-promotorene, Ocs-terminator-, Gus- eller NptII-gener) indikerer tilstedeværelsen av spesifikke fremmede DNA-sekvenser i den analyserte prøven, dvs. transgenisiteten til analysert DNA. Fraværet av farging etter analyse indikerer fraværet av spesifikke fremmede DNA-sekvenser i den analyserte prøven, dvs. ikke-transgeniteten til det analyserte DNA. Tilstedeværelsen av NC-farging indikerer et falskt positivt resultat. Årsaken kan være kontaminering av GMI-reagenser og/eller utstyr. I dette tilfellet er det nødvendig å behandle overflatene til laboratoriebenker og utstyr med en løsning av saltsyre (1 mol/dm3 i terninger), erstatte reagensene med ferske og gjenta analysen.

Analyse ved hjelp av biobrikker er i dag mye brukt i praksis. Det er preget av høy følsomhet, enkelhet i prosedyren, muligheten til å analysere flere parametere samtidig, spesifisitet og reproduserbarhet. Bruken av biologiske mikrobrikker kan være svært effektiv på områder som: påvisning av forurensning i mat og miljø, diagnostisering og prediksjon av sykdommer, påvisning av elementer av biologiske våpen, vurdering av medikamenteffektivitet. Utviklingen av biochip-teknologier i Russland er et av de høyteknologiske områdene som får spesiell oppmerksomhet.

Bibliografi

1. Shlyapnikova E. A., Shlyapnikov Yu M., Afanasyev V. N., Afanasyeva G. V., Gavryushkin A. V., Beletsky I. P. Studie av kvaliteten på aminomodifiserte substrater brukt til hybridiseringsanalyse // Bioorganisk kjemi 2006 nr. 4 S.68-86.

2. Shlyapnikova E. A., Shlyapnikov Yu M., Granovsky I. E., Afanasyeva G. V., Gavryushkin A. V., Beletsky I. P. "Biologiske mikrobrikker i medisin" Institute of Theoretical and Experimental Biophysics RAS.

3. Timofeev E., Mirzabekov A. (1998) Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for fremstilling av DNA- og DNA-oligonukleotidmikrochips og proteinmikrochips. Anal. Biochem., 259, 34-41.

4. Shishkina I. G., Levina A. S., Zarytova V. F. "Affine sorbenter som inneholder nukleinsyrer og deres fragmenter" // Advances in Chemistry // 2001. No. 70(6),.

5. Makretsov N.A., Huntsman D.G., Nielsen T.O., Yorida E., Peacock M., Cheang M.C., Dunn S.E., Hayes M., van de Rijn M., Bajdik C., Gilks ​​​​C.B. (2004) Hierarkisk klyngeanalyse av vevsmikroarray-immunfargingsdata identifiserer prognostisk signifikante grupper av brystkarsinom. Clin Cancer Res., 10(18 Pt 1), 6143-6151.

6. Hu S., Loo J.A., Wong D.T. (2006) Analyse av menneskelig kroppsvæskeproteom. Proteomics, 6(23), 6326-6353.

7. Ekins R.P. (1987) En oversikt over nåværende og fremtidig utvikling av ultrasensitiv ikke-isotopisk immunanalyse. Clin. Biochem. Rev. 8, 12-22.

8. Fukui S. et al. (2002) Oligosakkarid-mikroarrayer for høykapasitetsdeteksjon og spesifisitetstilordninger for karbohydrat-protein-interaksjoner. Nat.Biotechnol.20, 1011-1017.

9. Kononen J. et al. (1998) Vevsmikroarrayer for molekylær profilering med høy gjennomstrømning av tumorprøver. Nat.Med. 4, 844-847/

10. Wang et al. (2002) Karbohydratmikroarrayer for gjenkjennelse av kryssreaktive molekylære markører for mikroprober og vertsceller. Nat.Biotechnol.20, 275-281.

11. Perkel J.M. (2002) Vevsmikroarrayer: fremme av klinisk genomikk. The Scientist 21, 39.

12. Helmchen B., Weckauf H., Ehemann V., Wittmann I., Meyer-Scholten C., Berger I. (2005) Ekspresjonsmønster av cellesyklus-relaterte genprodukter i synovial stroma og synovial lining i aktive og rolige stadier av revmatoid artritt. Histol Histopathol., 20(2):365–372.

13. Hueber W., Kidd B.A., Tomooka B.H., Lee B.J., Bruce B., Fries J.F., Sonderstrup G., Monach P., Drijfhout J.W., van Venrooij W.J., Utz P.J., Genovese M.C., Robinson W.H. (2005) Antigen mikroarray profilering av autoantistoffer i revmatoid artritt. leddgikt Reum.; 52(9), 2645-2655.

14. Mobasheri A., Airley R., Foster C.S., Schulze-Tanzil G., Shakibaei M. (2004) Post-genomiske anvendelser av vevsmikroarrayer: grunnleggende forskning, prognostisk onkologi, klinisk genomikk og medikamentoppdagelse. Histol Histopathol., 19(1), 325-335.

15. Melentyeva G.A. Farmasøytisk kjemi. Bind 2, Moskva "Medisin" 1976. S.68

DNA-hybridiseringsanalyse ved bruk av biologiske mikromatriser

En DNA-mikrobrikke er vanligvis en liten polert silisiumplate med spesielle DNA-sonder festet til overflaten. Det er probene som er ansvarlige for DNA-gjenkjenning. En sonde er et lite kunstig syntetisert stykke DNA som er rettet mot å identifisere en enkelt mutasjon. Det er fra flere hundre til flere millioner prober på brikker fra forskjellige produsenter, og hver representerer en unik mutasjon.

Før analyse på en brikke isoleres DNA for eksempel fra spytt, renses for fremmede stoffer og kuttes i små fragmenter.

Deretter påføres løsningen med disse fragmentene på brikken og får stå en stund. Dette stadiet kalles inkubasjon. I løpet av denne tiden trenger fragmenter av DNAet som studeres inn mellom probene på brikken, og deretter kan prosessen ta to veier. I ett tilfelle, hvis sekvensen til DNA-fragmentet er et speilbilde (komplementært) til DNA-sekvensen til sonden, vil klumping (hybridisering) oppstå fordi de komplementære delene av DNA passer sammen som kantene på en glidelås. Hvis fragmentet bare er delvis lik proben eller ikke er lik i det hele tatt, vil hybridisering ikke forekomme og det vil fortsette å flyte fritt mellom probene.

Etter inkubering begynner et vasketrinn for å fjerne ubundne fragmenter fra brikken. I dette tilfellet fjernes ikke bare frie fragmenter, men også de som bare er delvis hybridisert. Hvis hybridisering skjer delvis, betyr det at fragmentet ikke passet helt inn i proben og må fjernes. Fullt komplementære DNA-fragmenter fester seg så godt til sonden at de ikke vaskes bort på dette stadiet.

Etter vask forblir prober assosiert med menneskelige DNA-regioner og frie prober på brikken.

På det siste stadiet skjer identifiseringen av de probene som fragmentene av DNAet som studeres er bundet til. Her er tilnærmingene forskjellige. For eksempel påføres et spesielt lysende merke på brikken, som bare er fast koblet til "utløste" sonder. De ubundne merkene vaskes av igjen, og deretter fotograferes brikken under et mikroskop. Resultatet er et rutenett av mange flerfargede prikker med forskjellige lysstyrker. Når du vet på hvilket tidspunkt hvilken sonde er lokalisert, kan du forstå nøyaktig hvilke DNA-sekvenser en person har, det vil si hvilke mutasjoner han har.

DNAet som studeres kuttes med spesielle enzymer, restriksjonsenzymer, som gjenkjenner spesielle kombinasjoner i nukleotidsekvensen og kuttes i henhold til dem. Disse spesielle kombinasjonene av nukleotider er spredt ganske jevnt over hele DNA, så fragmentene er ganske jevne i lengde.

Ensartet påføring på brikken oppnås ved å påføre fragmentene i form av en løsning. Og i den fordeler den termiske (brownske) bevegelsen molekylene jevnt. Alt som gjenstår er å påføre en dråpe av løsningen på stedet på brikken hvor probene er plassert. Og dette er ikke vanskelig - vanligvis har et slikt vindu på en brikke dimensjoner på ikke mer enn 10x10 mm.

Svar

Kommentar

) — en miniatyrplate med fragmenter av en kjent sekvens påført den i en bestemt rekkefølge for genetisk analyse.

Beskrivelse

En DNA-mikrobrikke er en enhet laget i analogi med elektroniske mikrokretser (brikker), designet for å oppdage mange spesifikke DNA-sekvenser samtidig. DNA-mikroarray brukes til å studere genuttrykk og søke etter mutasjoner i biomedisinsk forskning. Mikrobrikken er laget av glass, silikon eller plast. DNA påføres det ved hjelp av maskinmikrotrykk og kjemisk søm i form av mange ordnede prikker, som hver inneholder et like stort antall syntetiserte DNA-fragmenter med en unik sekvens. I andre teknologier for hybridiseringsanalyse av gener, blir komplementære DNA-fragmenter sydd til mikroskopiske perler. Moderne DNA-mikroarrayer kan samtidig måle uttrykket av titusenvis av gener hos mennesker og identifisere rundt en million mutasjoner. Driftsprinsippet til en mikrobrikke for å studere genuttrykk er som følger. Det aktive arbeidet til et gen i et gitt vev kommer til uttrykk i akkumuleringen av dets matrise (mRNA). Alle mRNA-er ekstraheres fra en vevsprøve, og ved hjelp av revers transkriptase-enzymet syntetiseres såkalt komplementært DNA (cDNA), som er mye mer stabilt og lettere å jobbe med enn mRNA. Det resulterende settet med cDNA merkes ved å bruke fluorescerende eller radioisotopmerker.

Innholdet av individuelle cDNA-er i en prøve er direkte proporsjonal med innholdet i mRNA-templatene deres og følgelig aktivitetsnivået til de tilsvarende genene. cDNA-blandingen påføres en mikrobrikke, ved hvert punkt hvor DNA-fragmenter som tilsvarer kodingssekvensen til ett av genene blir sydd. cDNA finner "sine" punkter og binder (hybridiserer) til dem i henhold til komplementaritetsprinsippet. Jo mer cDNA av en gitt art er i løsningen, jo mer av det er festet til punktet. En spesiell skanningsenhet bestemmer deretter cDNA-innholdet ved hvert punkt på mikrobrikken, og programmet korrelerer det med navnet på genet representert av det punktet. Resultatet av en DNA-mikroarray-studie er en matrise av punkter, hvis intensitet er direkte proporsjonal med aktiviteten til de tilsvarende genene.

Illustrasjoner

Forfattere

• Naroditsky Boris Savelievich
• Shirinsky Vladimir Pavlovich
• Nesterenko Lyudmila Nikolaevna

Kilder

1. DNA Chip Technology / Office of Science Education and Outreach: Forskningsteknikk faktaark URL: http://www.genome.gov/DIR/VIP/Learning_Tools/Fact_Sheets/dna_chip.html (åpnet 10/12/2009)
2. Ke Y., Stuart L., Yung C., Yan L., Hao Y. Selvmonterte vannløselige nukleinsyreprobefliser for merkefrie RNA-hybridiseringsanalyser.// Science – No. 5860 (319), 2008 – P .180-183

En viktig innovasjon innen molekylærbiologi har vært teknologien til biologiske mikromatriser. Denne teknologien gjør det mulig å bruke relativt små mengder utgangsmateriale, utføre reaksjonen i mikrovolumer, og samtidig utføre multiparameteranalyse av mange gener fra samme objekt.

Dens følsomhet er sammenlignbar med standard amplifikasjonsmetoder for DNA-diagnostikk og overskrider dem i noen tilfeller.

Avhengig av arten av de immobiliserte probene, er det 4 hovedtyper av biochips:

DNA-brikker;

RNA-brikker;

Protein mikrochips;

Celle mikrobrikker.

Mest brukt i forskning og klinisk praksis, spesielt for å analysere spekteret av ulike mutasjoner eller

alleliske varianter av forskjellige gener, oppnådde DNA-brikker. Vanligvis er de miniatyrgelplater med tallrike fordypninger og celler som inneholder et sett med DNA-prober (fig. 4.10), plassert på glass eller en membran. I løpet av de siste ti årene har mikromatristeknologi blitt et raskt utviklende anvendt område innen biologisk vitenskap: dusinvis av selskaper utvikler og tilbyr biologiske mikromatriser som inneholder matriser fra flere titalls til hundretusener eller flere DNA-sonder. Ved hjelp av biobrikker kan du også analysere DNA-endringer som translokasjoner, duplikasjoner, lange delesjoner, samt mikroduplikasjoner og mikrodelesjoner.

Teknologier for produksjon av DNA-brikker er forskjellige i størrelsen på de påførte DNA-fragmentene, immobiliseringsmetoder, hybridiseringsprosedyrer og deteksjonssystemer. I henhold til sluttfasen av deteksjonen er mikrobrikker av to typer: hybridisering og enzymatisk. Hybridiseringsbrikker, avhengig av metoden for å lese signalet, er delt inn i elektroniske (Nanogen) og fluorescerende (Affymetrix, Illumina, Biochip), etc. [Biochip: www.biochip. rn; Affymetrix: www.affymetrix.com; Applied Biosystems: www.europe. applicationbiosystems.com; Asper Biotech: www.asperbio.com; Illumina: www. illumina.com; Nanogen: www.nanogen.com].

I dette tilfellet kan diskriminering av mutasjoner skje både før hybridisering, det vil si under prøveprepareringsprosessen (brikker fra Applied Biosystems, Affymetrix), og under hybridiseringsprosessen (Biochip). Som et eksempel, la oss illustrere hybridiseringen

nye metoder for mutasjonsanalyse brukt av Biochip (1) og Affymetrix (2).

1. Mikroarray-teknologien som er foreslått og utviklet i Russland (Institute of Molecular Biology oppkalt etter V. A. Engelhardt RAS) involverer foreløpig multipleksamplifisering av DNA-fragmentene som studeres ved bruk av fluorescensmerkede primere (eller deoksynukleotidtrifosfater). Ved å tilsette et overskudd av en av primerne og utføre 2 replikasjonsrunder, oppnås dannelsen av en stor mengde overveiende merket enkelttrådet produkt. Sistnevnte påføres biobrikken, hvor den hybridiserer med oligonukleotidprober immobilisert i gelen (fig. 4.11). Hvis sekvensen til DNA-et som analyseres er fullstendig komplementær til sekvensen til DNA-proben, dannes en stabil dupleks, som lett oppdages på grunn av den fluorescerende etiketten. Imidlertid, hvis det ønskede fragmentet ikke er tilstede eller en ikke-komplementær base er tilstede i det, oppstår ikke en stabil dupleks (det er ikke noe fluorescenssignal). Denne metoden lar deg analysere opptil 50 polymorfe varianter med en nøyaktighet på mer enn 98%.

2. For analyse av genetisk polymorfisme og mutasjoner, ved bruk av "Affymetrix"-teknologien, antas det at

endre de såkalte "spesielle prøvene". Slike prøver består av flere fragmenter: H1 og H2 - spesifikke for DNA-sekvensen som analyseres; P1 og P2 - som er universelle primere og flankerer stedet for enzymklevasen; og en merkesekvens - en spesifikk merkelapp for å identifisere en spesifikk SNP under hybridisering på en mikroarray (fig. 4.12). Påvisning av mutasjoner skjer som følger: en "spesiell prøve" legges til testprøven som inneholder enkelttrådet DNA med ønsket mutasjon. Prøven hybridiserer komplementært med DNA-sekvensen til den analyserte prøven (fragmentene H1 og H2) (Fig. 4.12 A). Deretter tilsettes termostabil DNA-polymerase og fire forskjellige nukleosidtrifosfater (henholdsvis fire rør brukes). DNA-polymerase kompletterer 3'-enden av H1-proben med én base som tilsvarer den variable posisjonen (fig. 4.12 B). Deretter utføres en ligasereaksjon, hvor 5'-enden av den innsatte basen kobles til 3'-enden av H2-sonden (fig. 4.12 C). I neste trinn (Figur 4.12 D), ødelegger eksonukleasen gjenværende DNA fra den opprinnelige prøven. For ytterligere amplifikasjon kuttes ringmolekylet til prøven med spalte (fig. 4.12 E). Amplifikasjon utføres ved bruk av universelle primere P1 og P2 (fig. 4.12 F). Deretter hybridiseres prøvene med en mikrobrikke. Spesifisiteten til hybridisering oppnås på grunn av et spesialdesignet tag-fragment, som sammen med universelle primere er en av Asymetrix' know-how. Dermed kan opptil 1000 eller flere SNP-er entydig identifiseres i utvalget som studeres. Nøyaktigheten til metoden når man analyserer tusenvis av SNP-er er omtrent 90%.

3. Et annet lovende alternativ for biobrikker for analyse av genetisk polymorfisme er designet basert på SBE-metoden (single base primer extension), som gjør det mulig å oppnå en høy grad av diskriminering av hybridiseringssignaler på "mutant" og "vill" type alleler. Ved klargjøring av prøver blir DNA-fragmentet som studeres som inneholder markøren SNP først amplifisert, hvoretter det hybridiseres på en biochip. Probesekvensen må være komplementær til sekvensen til DNA-et som testes, inkludert dens siste base i 3'-enden, etterfulgt av det variable nukleotidet. Deteksjonsprinsippet er som følger: etter hybridisering av proben med prøven tilsettes dideoksynukleotider merket med forskjellige fargestoffer og DNA-polymerase til reaksjonen. På grunn av tilstedeværelsen av dideoksynukleotider, er det mulig å feste bare ett enkelt nukleotid til 3'-enden av den immobiliserte proben. Etter vask av brikken, bestemmes fluorescensen til testprøven av dette merkede dideoksynukleotidet. Når det gjelder graden av diskriminering mellom homozygote og heterozygote genotyper, er SBE-metoden i gjennomsnitt en størrelsesorden overlegen hybridisering med allelspesifikke prober. Ulempene med denne metoden er behovet for å syntetisere oligonukleotider immobilisert på en brikke med en fri 3'-ende, noe som utelukker bruken av metoden for den mest lovende typen brikker laget ved fotolitografi.

4. Konseptuelt lik SBE-teknologi er biobrikker laget på grunnlag av APEX-metoden (arrayed primer extension - komplettering av primere syntetisert på begge DNA-trådene). Forskjellen er at analysen tester ikke én, men begge DNA-trådene samtidig og bruker flere forskjellige immobiliserte prober for hver posisjon. Dette gjør det mulig å identifisere nye mutasjoner og polymorfe steder med høy grad av pålitelighet. Brikker basert på APEX-teknologi ble utviklet av det estiske selskapet Asper Biotech, vist i figur 4.13.

5. Flere varianter av hybridiseringsbiochips ble utviklet på grunnlag av Research Institute of AG oppkalt etter. D. O. Otta SZO RAMS. Ved å bruke en av

Med dem - en "farmakogenetisk biochip" - er det mulig å studere arvelig disposisjon for tilbakevendende spontanabort og leukemi hos barn. Biobrikken tillater analyse av 13 alleliske polymorfe steder av 7 gener i avgiftningssystemet: CYP1A1 (4887C>A, 4889A>G og 6235T>C), CYP2D6 (1934G>A og 2637delA), GSTM1 (sletting), GSTT1 (sletting) , NAT2 (481T >C,590A>G og 857A>G), CYP2C9 (430C>G og 1075C>T) og CYP2C19 (681G>A) og ett (677C>T) metylentetrahydrofolsyregen - MTHFR. Figur 4.14 viser resultatene av biochip-analyse ved bruk av spesiell programvare. "Farmagen-biochip" har allerede bestått kliniske studier og har blitt introdusert i laboratoriediagnostisk praksis ved flere medisinske sentre i den russiske føderasjonen. Biochips for testing av arvelig disposisjon for trombofili (“TROMBO-biochip”) og hjerte- og karsykdommer (“Cardiobiochip”) er på stadiet av kliniske studier. Det jobbes med å lage biobrikker for å teste hovedmutasjonene i CFTR-genet ved cystisk fibrose, samt arvelig disposisjon for bronkial astma og osteoporose.

6. Biobrikker som tillater genom-wide assosiasjonsscreening (Genome Wide Association Studies - GWAS) fortjener spesiell oppmerksomhet.

Nsp I Nsp I Nsp I

RE Fordøyelse

som et resultat av dette blir det mulig å identifisere alle markørgener, genomiske loci og individuelle markør-SNP-er assosiert med ulike MD-er (se kapittel 2, 3, 9). For dette formålet blir DNA-prøven som studeres utsatt for hydrolyse med visse endonukleaser, de resulterende fragmentene ligeres (kobles) med adapter-DNA-sekvenser og amplifiseres med en primer spesifikk for genomfragmentet som studeres. De resulterende PCR-fragmentene merkes med fluorescerende fargestoffer og hybridiseres med sett med DNA-prober plassert på biobrikken (fig. 4.15). Basert på resultatene av analyse av hybridiseringsmønsteret til biobrikken ved bruk av et spesielt dataprogram, vurderes det om den studerte prøven inneholder et bestemt sett med alleliske varianter av enkeltnukleotidsubstitusjoner - SNP (fig. 4.16). Sammenligning av frekvensene til de tilsvarende allelene hos syke og friske individer lar oss identifisere alle SNP-er og følgelig alle gener og DNA-loci assosiert med en spesifikk sykdom, det vil si å bestemme den spesifikke genetiske profilen til MD. Metoden gjør det mulig å studere opptil flere titalls og hundretusener av markører i en analyse, men nøyaktigheten overstiger ikke 90%. Derfor, i moderne tid

Denne metoden bør ikke betraktes mer som en søkemetode, men ikke diagnostisk. For tiden er metoden vellykket brukt for genomomfattende screening av assosiasjoner til ulike MDer, inkludert diabetes type 1 og type 2, koronarsykdom, bronkial astma, Crohns sykdom, manisk-depressiv psykose, etc. (se avsnitt 1, 6.1, 6.3) , 9).

7. Betydelige fremskritt i å øke effektiviteten, nøyaktigheten og kostnadene ved mutasjonstesting har vært utviklingen de siste to årene, rettet mot å kombinere de utvilsomme fordelene med sanntids PCR-metoden med prinsippene for biochip-diagnostikk (fig. 4.17). Dermed kan du ved å bruke en biochip fra Fluidigm samtidig analysere mutasjoner eller teste SNP-er i 9216 loci. Metoden har større spesifisitet og nøyaktighet enn den genomomfattende GWAS-screeningsmetoden (se avsnitt 4.6.). Kostnaden for å studere en mutasjon/polymorfisme overstiger ikke 1 rubel.

Bruk dine eksisterende TaqMan-analyser: 99 % analysekonverteringsrate fra 384-brønns system