Dyrking av mikroorganismer. Generell mikrobiologi

For å isolere en ren kultur av mikroorganismer, studere deres biologiske egenskaper for identifikasjonsformål, og også for å oppnå biomasse, er det nødvendig å forplante mikroorganismer i et laboratorium. Dyrking, eller dyrking, av mikrober er bare mulig hvis visse forhold skapes for deres livsaktivitet. De fleste bakterier, gjær og muggsopp dyrkes i kunstige næringsmedier. Virus og rickettsiae formerer seg bare i levende celler, vevskulturer, kyllingembryoer eller i dyrekroppen.

Kunstige medier som brukes til dyrking av mikroorganismer må oppfylle visse krav: være lett fordøyelig, med den nødvendige sammensetningen av nitrogenholdige og karbohydrater, vitaminer, den nødvendige saltkonsentrasjonen, med en viss pH-verdi (middels pH); har bufferegenskaper; har et optimalt redokspotensial.

Næringsmedier må også inneholde tilstrekkelig mengde vann og må være sterile, dvs. frie for mikroorganismer før såing. Kilden til nitrogen i media kan være ulike organiske, og sjelden uorganiske forbindelser. Pepton, som er et produkt av ufullstendig proteinhydrolyse, tilsettes ofte til proteinfrie medier. Proteolytiske mikroorganismer kan bruke gelatin («dyregelé») som nitrogenholdig substans. Kilden til karbon i næringsmedier er ofte karbohydrater, alkoholer og noen organiske syrer.

For å tilberede kunstige næringsmedier, kan du bruke ulike naturlige produkter: melk, blod, myse, kjøtt, kylling eggeplomme, poteter og andre organiske stoffer og mineralsalter.

Kunstige næringsmedier er delt inn i fire hovedgrupper i henhold til deres tiltenkte formål: universell, spesiell, selektiv (elektiv) og differensialdiagnostisk.

Universelle medier inkluderer kjøtt-pepton-buljong og kjøtt-pepton-agar, som mange typer patogene og ikke-patogene bakterier vokser på. Spesielle medier brukes til å dyrke bakterier som ikke formerer seg på universelle medier. Spesielle medier inkluderer melk, blodserum, med tilsetning av dyreblod, glukose, etc. Melkesyrebakterier, patogene og andre mikroorganismer dyrkes på dem.

I selektive (elektive) miljøer utvikler bare bakterier av visse arter seg godt. Slike miljøer inkluderer anrikningsmiljøer der arten av interesse for forskeren vokser raskere enn de medfølgende bakteriene. For eksempel er Kesslers medium, som inneholder gentianfiolett og storegalle, selektivt for gramnegative Escherichia coli som er resistente mot disse stoffene og samtidig selektivt for sensitive grampositive bakterier.

Differensialdiagnostiske medier brukes til å differensiere visse typer bakterier i henhold til deres kulturelle og biokjemiske egenskaper. Disse inkluderer:

medier for å bestemme proteolytisk aktivitet (kjøttpeptongelatin - MPG, melkagar, etc.);

medier for å bestemme gjæring av karbohydrater (Hiss, Endo, Ploskirev media, etc.);

medier for å bestemme hemolytisk evne (blodagar og andre medier med tilsetning av dyreblod);

medier for å bestemme den reduserende (reduserende) evnen til mikroorganismer (Wilson-Blair-medium);

selektive medier som brukes til å skille prototrofe og auxotrofe bakterier.

Konsistensen til næringsmedier kan være fast, halvflytende eller flytende. For å oppnå medier med en tett konsistens, tilsett 2-2,5 % agar eller 10-20 % gelatin til flytende medier. Halvflytende medier oppnås ved å tilsette 0,5-1,0 % agar. Agar (i malaysisk "gelé") - tett en fibrøs stoff hentet fra røde alger og danner en tett gel (gelé) i vandige løsninger Den består hovedsakelig av polysakkarider (70-75%) Hovedkomponentene i agar er høymolekylære stoffer agarose og agaropeptin, som ikke brytes ned og ikke absorberes av mikroorganismer. Derfor er agar ikke et næringssubstrat, det tilsettes til media utelukkende for å oppnå en tett konsistens.Agar smelter i vann ved 100 °C og stivner ved 40-43 °C. Den produseres i form av gulaktig tallerkener eller gråhvitt pulver.

De osmotiske forholdene som er nødvendige for mikrobers liv, skapes i næringsmediet ved å tilsette natriumklorid eller en viss kombinasjon av natriumfosfat- og kaliumfosfatsalter.

For livet til mikroorganismer er reaksjonen til miljøet av stor betydning - pH-verdien, som bestemmes av forholdet mellom hydrogen (H +) og hydroksyl (OH -) ioner. Det er logaritmen av antall absolutte konsentrasjoner av hydrogenioner.

Hydrogenindeksen for en nøytral reaksjon tilsvarer 7,0. I dette tilfellet er antallet hydrogenioner lik antallet hydroksylioner. En lesning under 7,0 indikerer en sur reaksjon, og en lesning over 7,0 indikerer en alkalisk reaksjon. Mikroorganismer har tilpasset seg å utvikle seg under forhold med et ekstremt bredt pH-område - fra 2,0 til 8,5. De fleste saprofytiske og patogene mikroorganismer dyrkes i et lett alkalisk reaksjonsmedium med en pH på 7,2-7,4. For dyrking av melkesyrebakterier, gjær og muggsopp kreves et surt reaksjonsmiljø, pH 5,0-6,5.

For tiden produseres mange næringsmedier i form av ferdige tørre halvfabrikata som inneholder alle ingrediensene som er nødvendige for mikroorganismers liv. For å tilberede næringsmediet, fortynnes pulveret med vann, den resulterende blandingen kokes, den nødvendige pH-verdien justeres og steriliseres.

Temperaturforhold er av stor betydning for vekst og reproduksjon av mikroorganismer på kunstige næringsmedier. I forhold til temperaturregimet er alle mikroorganismer delt inn i tre grupper: psykrofile (kaldelskende), mesofile (gjennomsnittlig), termofile (varmeelskende). Temperaturgrensene for reproduksjon for psykrofiler varierer fra 0 til 20 °C, for mesofiler - fra 20 til 45 °C, for termofile - fra 45 til 70 °C.

Ved dyrking av aerobe dyrkes avlingene i termostater med tilgang til atmosfærisk oksygen, det vil si under normale forhold. For dyrking av anaerober skapes oksygenfrie forhold, som kan oppnås ved fysiske, kjemiske og biologiske metoder. Anaerobe termostater brukes også.

Fysiske metoder er basert på å skape et vakuum i spesielle anaerobe apparater eller i vakuumekssikkatorer, hvor avlinger først plasseres, og deretter skapes et vakuum i apparatet.

Noen ganger blir luften i anaerostater erstattet med karbondioksid, nitrogen eller annen inert gass. Tilgangen av oksygen til næringsmediet kan bli hemmet hvis anaerober dyrkes dypt i en kolonne av næringsagar eller inne i forseglede glassrør. Anaerobe forhold kan skapes enda mer på enkle måter: bruk av et lag med agar hellet over avlinger på et tett næringsmedium, eller bruk av vaselinolje, som brukes til å dekke et flytende næringsmedium (Kitta-Tarozzi medium).

Kjemiske metoder bestå i å plassere i en ekssikkator med avlinger kjemiske substanser for eksempel pyrogallol og alkali, reaksjonen mellom disse skjer med absorpsjon av oksygen.

Den biologiske metoden er basert på samtidig dyrking av aerober og anaerober på faste næringsmedier i hermetisk lukkede petriskåler. I dette tilfellet absorberes oksygen ved å vokse aerober sådd på den ene halvdelen av mediet, hvoretter veksten av anaerober begynner, sådd på den andre halvdelen.

DANNING AV PIGMENT OG AROMATISKE STOFFER VED MIKROORGANISMER. GLØD AV MIKROBER

Pigmenter. Noen typer bakterier og sopp som lever i jord, vann og luft er i stand til å produsere fargestoffer som kalles pigmenter.

Pigmenter er delt inn i vannløselige, alkoholløselige, vannuløselige og alkoholuløselige. Det er også kromoparpigmenter som kommer inn i det ytre miljøet, og kromoforiske pigmenter lokalisert i cytoplasma, vakuoler og membran.

Dannelsen av pigmenter skjer med god tilgang på oksygen, hos de fleste arter i diffust sollys og en optimal temperatur på 20-25 °C.

Mikroorganismer skiller ut forskjellige pigmenter, hvis farge bestemmes av fargen på kolonier på et fast næringsmedium, og noen ganger av fargen på et flytende næringsmedium. Det vannløselige blå pigmentet pyocyanin produseres av Pseudomonas aeruginosa. Pigmentet forårsaker defekter i melk, og gjør den blå. Det grønne vannløselige pigmentet fluorescein produseres av fluorescerende staver (Ps. fluorescens); Det røde, alkoholløselige pigmentet prodigiosin produseres av mirakelpinnen (Serratia marcescens). Røde pigmenter kan også produseres av actinomycetes og gjær, rosa pigment av gjær og rosa mikrokokker. Stafylokokker produserer gyldne, hvite og gule blomster. Sarcin-kolonier er gule, sitron- eller gylne i fargen. Muggsopp produserer hovedsakelig vann- og alkoholuløselige pigmenter av svarte, grønne, brune og sjokoladebrune farger. Brunt pigment produseres av noen stammer av sporedannende forråtningsaktive aerober (sopppinner, kålstaver).

I mangel av gunstige forhold produserer ikke pigmentdannende mikroorganismer pigmenter og danner fargeløse (gråhvite kolonier).

Pigmentdannelse i mikrober har en viss fysiologisk betydning. Pigmenter gir cellebeskyttelse mot naturlig ultrafiolett stråling, deltar i biokjemiske reaksjoner og har en antibiotisk effekt.

Aromatiske stoffer. Noen mikroorganismer produserer under sine livsprosesser flyktige aromatiske stoffer som gir meieriprodukter (smør, ost) en behagelig spesifikk lukt og smak. Av disse stoffene er de viktigste diacetyl, flyktige syrer, etylalkohol, etylacetat og amylacetatetere, etc.

Blant melkesyrebakterier er aromadannelsen mest intens hos heterofermentative melkesyrestreptokokker Lactococcus diacetylactis, Leuconostoe cremoris, Leuconostoc dextranicum.

Intensiteten av aromadannelsen påvirkes av melkegjæringstemperaturen, reaksjons- og redoksforholdene i miljøet. De optimale forholdene for aromadannelse for melkesyrestreptokokker er: temperatur 23-25 ​​​​° C; pH i miljøet er ca. 5,0; redokspotensial Eh 6; periodisk omrøring av starteren for å berike den med oksygen.

Ved langtidslagring av produktet ødelegges aromatiske stoffer, spesielt ved høye temperaturer over null.

Gløde mikroorganismer. Glød (luminescens) er en unik form for energifrigjøring under oksidative prosesser. Glødende mikroorganismer kan få ulike matvarer (kjøtt, fisk, ost osv.) til å gløde. De trenger gjennom kroppen til små krepsdyr, og får disse dyrene til å gløde sterkt om natten nær kysten. Hos noen fisk er lysende bakterier permanente symbionter (samboere), som tjener som lyskilde. Noen sopp som lever i gamle stubber og trerøtter gløder.

Glødende bakterier kalles fotobakterier. Disse inkluderer noen kokker, vibrioer og stenger som flekker negativt på Gram og ikke danner sporer.

De fleste arter av lysende bakterier er aerobe, de forårsaker ikke forråtnelse, vokser på fisk og kjøttsubstrater, og dyrkes i vanlige miljøer. Den optimale vekst- og glødetemperaturen er 15-18 ° C, natriumkloridinnholdet er omtrent 3%. En typisk representant for fotogene mikrober er Fotobacterium phosphoreum - en ikke-bevegelig kokkoidstav som utvikler seg ved 28 °C; veksten stopper ved temperaturer over 30 °C. Proteolytiske egenskaper uttrykkes ikke, gelatin blir ikke flytende.

Utviklingen av fotogene mikrober undertrykkes ved å redusere konsentrasjonen av salter i miljøet, under påvirkning av sulfonamid og andre kjemikalier, lydvibrasjoner, mekanisk gnidning, ekstraksjon med ulike løsemidler, langsom autolyse, etc.

Etter temperatur optimal vekst

Anatoksiner

Billett nummer 26

1. Grunnleggende prinsipper for bakteriedyrking Næringsmedier.Grunnleggende prinsipper for dyrking av mikroorganismer på næringsmedier. 1. Bruk av alle næringskomponenter som er nødvendige for de tilsvarende mikrober 2. Optimal temperatur, pH, rH 2, ionekonsentrasjon, grad av oksygenmetning, gasssammensetning og trykk Mikroorganismer dyrkes på næringsmedier ved optimal temperatur i termostater som gir inkubasjonsbetingelser. Etter temperatur optimal vekst Det er tre hovedgrupper av mikroorganismer: 1. Psykrofiler - vokser ved temperaturer under +20 grader Celsius 2. Mesofiler - vokser i temperaturområdet fra 20 til 45 grader (ofte optimalt ved 37 grader C) 3. Termofile - vokser ved temperaturer over pluss 45 grader. Korte karakteristikker av næringsmedier. Basert på konsistens skilles flytende, tette (1,5-3 % agar) og semi-flytende (0,3-0,7 % agar) medier. Agar er et polysakkarid av kompleks sammensetning fra tang, hovedherderen for tette (faste) medier. Som en universell kilde til karbon og nitrogen brukes peptoner - produkter av proteingjæring med pepsin, forskjellige hydrolysater - kjøtt, fisk, kasein, gjær, etc. I henhold til formålet med mediet er de delt inn i en rekke grupper:

Universal (enkel), egnet for ulike lite krevende mikroorganismer (kjøtt-pepton-buljong - MPB, kjøtt-pepton-agar - MPA); - spesielle - medier for mikroorganismer som ikke vokser på universelle medier (McCoy's medium for tularemia, Levenshtein-Jensen medium for årsaken til tuberkulose); - differensialdiagnostikk - for å differensiere mikroorganismer ved enzymatisk aktivitet og kulturelle egenskaper (Endo, Ploskirev, Levin, Gissa media);

Selektiv (elektiv) - for å isolere visse typer mikroorganismer og undertrykke veksten av tilknyttede mikroorganismer - peptonvann, selenittmedium, Mullers medium Basert på opprinnelsen til mediet deles de inn i naturlig, semisyntetisk og syntetisk.

Billett nummer 27

Anatoksiner

Preparater som inneholder kjemisk modifiserte eksotoksiner, uten giftige egenskaper, men som beholder høy antigenisitet og immunogenisitet. Disse stoffene gir produksjon av antitoksisk immunitet (antitoksiske antistoffer - antitoksiner). De mest brukte er difteri og tetanustoksoider. DTP - assosiert pertussis-difteri-stivkrampevaksine.

3 . meslingvirus- en representant for slekten Morbillivirus av paramyxovirusfamilien. Den mangler neuraminidase. Den har hemagglutinerende, hemolytisk og symplastisk aktivitet. Viruset har hemagglutinin, hemolysin (F), nukleoprotein (NP) og matriseprotein, som er forskjellige i antigen spesifisitet og immunogenisitet. Laboratoriediagnostikk.1 Ekspressdiagnostisk metode - påvisning av virale antigener ved bruk av fluorescerende antistoffer i berørte celler. 2. Virologisk diagnose - blod undersøkes før utseende av utslett, slim fra nasopharynx undersøkes for infeksjon av cellekulturer. Den cytopatiske effekten bestemmes, viruset identifiseres i RTGA, RN og MFA.3. Serologiske metoder - RSK, RTGA, ELISA. Spesifikk forebygging.Levende svekkede vaksiner brukes. I kontakter kan seroprofylakse utføres med immunglobulin mot meslinger eller normalt donor-immunoglobulin 3.65 Poliovirus . Poliomyelitt: Poliovirus forårsaker poliomyelitt, en akutt infeksjon som skader nevroner. Den viktigste biologiske egenskapen til poliovirus er tropisme for de motoriske cellene i den grå substansen i ryggmargen Virionkapsiden dannes av fire proteiner som danner den ytre (VP1, VP2, VP3) og indre (VP4) overflate av kapsiden. . Envelope-proteiner er viktige for gjenkjennelse og binding til cellulære reseptorer, frigjøring av virion-RNA inne i cellen, og utvikling av lammelser.Basert på deres antigene egenskaper deles poliovirus inn i tre typer; type 1 poliovirus har størst virulens og epidemi. aktivitet. Laboratoriediagnostikk 1. Virologisk diagnose inkluderer isolering av viruset på ulike cellekulturer eller på nyfødte hvite mus, etterfulgt av identifikasjon ved cytopatisk effekt, i RN, RTGA, RSC med referansesera.2. Serologisk diagnose utføres i forskjellige reaksjoner (for tiden - ELISA), det er nødvendig å studere parede sera og identifisere spesifikke IgM-antistoffer. Immunitet og spesifikk forebygging.Immuniteten mot poliovirus er varig, forårsaket av virusnøytraliserende antistoffer og immunminneceller. For spesifikk forebygging brukes drepte og levende svekkede vaksiner.

Billett nummer 28

1. Grunnleggende metoder for å dyrke virus.

1. I kroppen til laboratoriedyr 2. I kyllingembryoer 3. I cellekulturer - hovedmetoden. Typer cellekulturer . 1. Primære (trypsiniserte) kulturer - kyllingembryofibroblaster (CHF), humane fibroblaster (CHF), nyreceller fra forskjellige dyr, etc. Primærkulturer oppnås fra celler i ulike vev oftest ved knusing og trypsinisering og brukes én gang, dvs. det er alltid nødvendig å ha passende organer eller vev 2. Diploide cellelinjer er egnet for gjentatt spredning og vekst, som regel ikke mer enn 20 passasjer (mister sine opprinnelige egenskaper) 3. Transplanterbare linjer (heteroploide kulturer), i stand til gjentatt spredning og transplantasjon, dvs. til flere passasjer, mest praktisk i virologisk arbeid - for eksempel tumorcellelinjer Hela, Hep, etc. 2. Forsinket overfølsomhet (DTH)- cellemediert overfølsomhet eller type 4-overfølsomhet assosiert med tilstedeværelse av sensibiliserte lymfocytter. Effektorceller er DTH T-celler har CD4-reseptorer Sensibilisering av T-celler i HRT kan være forårsaket av kontaktallergimidler (haptener), antigener fra bakterier, virus, sopp og protozoer. Lignende mekanismer i kroppen forårsaker tumorantigener i antitumorimmunitet, genetisk fremmede antigener fra donor ved transplantasjonsimmunitet T-celler i DTH gjenkjenner fremmede antigener og skiller ut gamma-interferon og ulike lymfokiner, stimulerer cytotoksisiteten til makrofager, forsterker T- og B-immunet. respons, forårsaker forekomsten av en inflammatorisk prosess Historisk sett ble HRT påvist i hudallergitester (med tuberkulin - tuberkulintest), påvist 24 - 48 timer etter intradermal injeksjon av antigenet. Kun organismer med tidligere sensibilisering av dette antigenet reagerer på utviklingen av HRT til det administrerte antigenet Et klassisk eksempel på infeksiøs HRT er dannelsen av et infeksiøst granulom (ved brucellose, tuberkulose, tyfoidfeber, etc.). Histologisk er HRT preget av infiltrasjon av lesjonen først av nøytrofiler, deretter av lymfocytter og makrofager. Sensibiliserte T-celler av DTH gjenkjenner homologe epitoper presentert på membranen til dendrittiske celler, og skiller også ut mediatorer som aktiverer makrofager og tiltrekker andre inflammatoriske celler til stedet. Aktiverte makrofager og andre celler involvert i DTH frigjør en rekke biologisk aktive stoffer, forårsaker betennelse og ødelegge bakterier, svulster og andre fremmede celler - cytokiner (IL-1, IL-6, alfa-tumornekrosefaktor), aktive oksygenmetabolitter, proteaser, lysozym og laktoferrin. 3. Stafylokokker . Slekten omfatter mer enn 20 arter, hvorav de viktigste er S.aureus, S.epidermidis, S.saprophyticus Gram-positive kokker, som er preget av gjensidig oppstilling i klaser i form av drueklaser. De har en mikrokapsel, danner ikke sporer, og har ikke flageller Fakultative anaerober, kjemoorganotrofer. De vokser godt på enkle næringsmedier. På tette medier danner de ugjennomsiktige runde (2-4 mm i diameter) jevne kolonier, farget i fargen på lipokrompigment (krem, gul, oransje). I tillegg til S-former kan kolonier danne R-former. I flytende medier produserer de jevn turbiditet, da dannes det et løst bunnfall.De har høy biokjemisk aktivitet, danner ulike enzymer: Katalase er positiv, oksidase er negativ. Karbohydrater gjærer til syre uten gass, gjør gelatin flytende for å danne en trakt og danner hydrogensulfid. Basert på tilstedeværelsen av koagulase, er de delt inn i to grupper - koagulase-positive og koagulase-negative. Blant de patogene artene er det kun S.aureus som er positiv for koagulase, resten er negative Artsspesifikke antigener er teichoic syrer, protein A av Staphylococcus aureus. Giftstoffer har antigene egenskaper. Patogenisitetsfaktorer mikrokapsel, celleveggkomponenter (teikosyrer, protein A), enzymer og giftstoffer. Adhesjonsfaktorer er de høye hydrofobe egenskapene til overflatestrukturer. Celleveggkomponenter stimulerer utviklingen av inflammatoriske reaksjoner, med nøytrofiler som spiller en stor rolle. En rekke stafylokokkenzymer spiller rollen som aggresjon og forsvarsfaktorer. Hovedfaktoren er plasmakoagulase, som koagulerer blodserum (plasma) og danner et trombinlignende stoff som omslutter stafylokokker og forhindrer virkningen av kroppens forsvarsreaksjoner. Eksotoksiner: Membranskadelige toksiner kan skade røde blodlegemer (hemolysiner), leukocytter, makrofager, blodplater osv. Det er flere typer som er forskjellige i antigenstruktur, spektrum av lyserte celler og virkningshastighet Eksfoliative toksiner har en dermatonekrotisk effekt ( pemfigus hos nyfødte) Eksotoksin som forårsaker toksisk syndrom sjokk. Svært absorberende tamponger forårsaket alvorlig endotoksisk sjokk hos kvinner Enterotoksiner assosiert med matforgiftning. Enterotoksiner er varmestabile proteiner med superantigenegenskaper. De forårsaker overdreven syntese av interleukin 2, som forårsaker forgiftning. Rus er oftest forbundet med inntak av meieriprodukter infisert med stafylokokker.5. En rekke eksotoksiner og andre strukturer av stafylokokker har en allergifremkallende effekt, og forårsaker effekten av utvikling av HRT. Tilstedeværelsen av kryssreagerende antigener bidrar til utviklingen av autoimmune prosesser.6. Faktorer som hemmer fagocytose - kapsel, protein A, teichoic syrer, peptidoglykan, toksiner. Spesielle egenskaper til patogenet. 1. Evnen til å påvirke nesten alle vev og organer.2. Svært høy motstand blant ikke-sporedannende bakterier mot miljøfaktorer.3. Konstant tilstedeværelse på hud og slimhinner som kommuniserer med det ytre miljø.4. Superantigeniske egenskaper.5. Høy variabilitet og antibiotikaresistens, som er viktig for epidemien. Post-infeksiøs immunitet for stafylokokkinfeksjoner kan deles inn i cellulære og humorale, antibakterielle og antitoksiske Antitoksiner, antibakterielle antistoffer, antistoffer mot patogenisitetsenzymer, T-lymfocytter, fagocytter (vevsmakrofager i lokaliserte former) spiller en viktig rolle i beskyttelsen. Laboratoriediagnostikk. Det brukes bakteriologiske, mikroskopiske og serologiske metoder. Den viktigste er den bakteriologiske metoden Materialet for forskning er blod, puss, slim fra nese og svelg, sårutslipp, oppspytt (ved lungebetennelse), avføring (ved kolitt), mistenkelige produkter, oppkast og mageskylling, avføring - f.eks. matforgiftning Det utføres en bakterioskopi som identifiserer gram-positive kokker i form av drueklaser (stafylokokker). Materialet er sådd på enkle næringsmedier. Mistenkelige kolonier selekteres og subkultureres for studier på differensielle medier - blodagar (hemolyse), melkesalt og melkeplomme-saltagar (på grunn av NaCl hemmes veksten av fremmed mikroflora, bruk av media gjør det mulig å bedre identifisere pigment og lecitinase). Den isolerte kulturen identifiseres ved artsegenskaper, tilstedeværelse av gyllent pigment, plasmakoagulaseaktivitet, mannitolfermentering, hemolyse, følsomhet for antibiotika bestemmes, og fagtyping utføres Av de serologiske testene brukes RPHA og ELISA oftest for å påvise antistoffer. til artsspesifikke antigener (teichoic syrer) For å bestemme enterotoksigenisitet brukes de oftere en biologisk metode, bestemmelse av enterotoksin i utfellingsreaksjonen i agar, bestemmelse av RNase (korrelerer med produksjon av enterotoksin). Forebygging og behandling For å utføre adekvat antimikrobiell terapi er det nødvendig å bestemme kulturens følsomhet overfor antibiotika (primært overfor betalaktamer); i alvorlige og langvarige tilfeller brukesin. For å skape immunitet brukes stafylokokktoksoid, som skaper antitoksisk immunitet.

Billett nummer 29

1. Antibiotika En av de universelle mekanismene for antagonisme av mikroorganismer er syntesen av antibiotika, som hemmer vekst og reproduksjon av mikroorganismer (bakteriostatisk effekt) eller dreper dem (bakteriedrepende effekt). Antibiotika er stoffer som kan fås fra mikroorganismer, planter, dyrevev og syntetisk, som har uttalt biologisk aktivitet mot mikroorganismer Det stilles en rekke krav til antibiotika - effektivitet i lave konsentrasjoner - stabilitet i kroppen og under ulike lagringsforhold; - lav toksisitet eller fravær av den; - uttalt bakteriostatisk og (eller) bakteriedrepende effekt; - fravær av uttalte bivirkninger; - fravær av immunsuppressive effekter. De første antibiotikaene som ble oppdaget var penicillin (Fleming) og streptomycin (Waxman).

Antibiotika kan deles inn etter opprinnelse, retning og virkningsspektrum, etter virkningsmekanisme.Etter opprinnelse kan antibiotika være: - bakteriell (polymyxin, gramicidin); - actinomycete (streptomycin, kloramfenikol, erytromycin); - sopp (penicillin); - plante (rafanin, fytoncider); - animalsk opprinnelse (interferoner, lysozym). til spekteret er antibiotika delt inn i: - virker hovedsakelig på gram-positiv mikroflora - penicillin, erytromycin; - virker hovedsakelig på gram-negativ mikroflora - polymyxin; - bredspektret (på gram-pluss og gram-minus flora) - streptomycin, neomycin; - soppdrepende - nystatin, amfotericin, levarin, nizoral; - antituberkulose - streptomycin, kanamycin; - antitumor - rifampicin; - antiviralt - interferon, zovirax, acyclovir. Antibiotika er delt inn i henhold til deres virkningsmekanisme: - hemmere av cellevegg-peptikoglykan syntese (penicillin, cefalosporin, vankomycin, ristomycin). Virke på voksende bakterier med en cellevegg, ikke virke på L-former, hvilende former av bakterier; - proteinsyntesehemmere (streptomycin, kloramfenikol, tetracyklin); - hemmere av syntesen av nukleinsyrer, puriner og aminosyrer (nalidiksinsyre) , rifampicin); - syntesehemmere membraner og cytoplasmatisk membran av sopp (nystatin, polymyxin).

3. Pneumokokker. En spesiell posisjon i slekten Streptococcus er okkupert av arten S. pneumoniae (pneumokokker)- etiologisk middel for lobar lungebetennelse, akutte og kroniske inflammatoriske lungesykdommer. Det skiller seg fra andre streptokokker i morfologi (vanligvis er diplokokker i form av en lysflamme, med flate ender vendt mot hverandre, har en uttalt kapsel), antigen spesifisitet (de har 83 serovarer for kapselpolysakkaridantigenet), høy følsomhet for galle og optochin, og forårsaker alfahemolyse. Hovedfaktoren for patogenisitet er polysakkaridkapselen. Laboratoriediagnostikk. Den viktigste diagnostiske metoden er bakteriologisk. Materiale for forskning - blod, puss, slim fra halsen, plakk fra mandlene, sårutslipp. Den avgjørende faktoren i studiet av isolerte avlinger er bestemmelsen av serogruppen (arten). Gruppespesifikke antigener bestemmes i utfellingsreaksjonen, lateksagglutinasjonen, koagglutinasjonen, ELISA og i MFA med monoklonale antistoffer (MAbs). Serologiske metoder brukes oftere for å diagnostisere revmatisme og glomerulonefritt av streptokokketiologi - antistoffer mot streptolysin O og streptodornase bestemmes.

Dyrking av mikroorganismer kan utføres ved overflate eller dype, batch- eller kontinuerlige metoder, under aerobe eller anaerobe forhold. Av stor betydning ved valg av dyrkingsmetode er forholdet mellom mikroorganismen valgt for dyrking og molekylært oksygen og det endelige målet for dyrking: akkumulering av biomasse eller produksjon av en viss metabolitt (alkohol, oksygen, enzym, etc.).

Når det dyrkes etter overflatemetoden mikroorganismer dyrkes på overflaten av et tett, granulært medium eller i et tynt lag av et flytende medium, mens mikroorganismene får oksygen direkte fra luften. I flytende medier vokser ofte aerobe mikroorganismer og danner en film på overflaten. Fakultative anaerober utvikles ikke bare på overflaten, men også i tykkelsen av det flytende mediet, noe som forårsaker dets mer eller mindre jevne turbiditet. Enzympreparater oppnås ved bruk av bulkmedier ved bruk av overflatemetoden. Overflatedyrking av mikroorganismer brukes både i laboratorieforhold og i industrien.

Alle metoder for å dyrke aerobe mikroorganismer koker ned til å øke overflatearealet av kontakt av næringsmediet med atmosfærisk oksygen. Under dypdyrking I flytende medier bruker mikroorganismer oppløst oksygen. Samtidig er oppløseligheten av oksygen i vann lav, derfor, for å sikre vekst av aerobe mikroorganismer i tykkelsen av mediet, må det konstant luftes (tilfør oksygen dypt inn i det flytende mediet). Kombinasjonen av et næringsmedium og mikroorganismer som vokser i det kalles kulturvæske .

Den mest brukte metoden for dypdyrking i laboratoriepraksis er dyrking på gyngestoler, som gir risting eller rotasjon av kolber eller reagensrør, noe som sikrer større kontakt av mediet med luft og metning med oksygen. Lufte kulturen av mikroorganismer kan blåses ( bobler) gjennom et lag med steril luft. Denne metoden brukes i laboratorieforskning, men det har funnet spesielt bred anvendelse i industriell mikrobiologi i produksjon av biomasse, i produksjon av antibiotika, enzymer og syrer.

Fordelene med dypdyrking er at denne metoden ikke krever store arealer og klumpete utstyr, volumet av fermentorer kan økes ved å øke høyden, enkelt vedlikehold, muligheten for automatisering og bekvemmeligheten av å isolere målproduktet fra kulturen væske.

Dypdyrking av mikroorganismer kan være periodisk eller kontinuerlig. På periodisk metode Under dyrking blir hele volumet av næringsmediet sådd med en renkultur, og dyrking utføres under optimale forhold i en viss tid inntil den nødvendige mengden av målproduktet er akkumulert. Siden dyrkingen foregår på et ikke-fornybart næringsmedium (under stasjonære forhold), er cellene hele tiden i skiftende forhold. Først har de en overflod av alle næringsstoffer, så kommer det gradvis mangel på næring og forgiftning med skadelige stoffskifteprodukter. I denne forbindelse går kulturen i sin utvikling gjennom fire faser av vekst og reproduksjon, hvor cellestørrelser, reproduksjonshastigheter, morfologiske og fysiologiske egenskaper endres (fig. 3.1).

Første etappe– etterslepfasen, eller fasen med vekstinhibering, følger umiddelbart etter innføring av frømateriale i næringsmediet. I denne fasen formerer ikke mikroorganismer seg, men tilpasser seg miljøet, innholdet av nukleinsyrer øker og størrelsen øker. Dette stadiet er forberedelse for videre intensiv proteinsyntese av cellen, dvs. dens vekst og reproduksjon.

Andre trinn– den logaritmiske vekstfasen (eksponentiell) er preget av høy celleproduksjonshastighet, siden miljøet inneholder mye næringsstoffer og lite skadelige produkter Utveksling. Tiden som kreves for at antall celler skal dobles kalles generasjonsvarighet. Under gunstige forhold deler bakterieceller seg hvert 20.-30. minutt, antallet øker inn geometrisk progresjon(1, 2, 4, 8, 16 osv.).

Tredje trinn – stasjonær (modenhetsfase), når reproduksjonen av mikroorganismer bremses, og reproduksjons- og dødsratene er balansert, som et resultat av at antall celler forblir konstant.

Fjerde trinn– dødsfasen, når celledød begynner og antallet reduseres på grunn av død og autolyse (selvfordøyelse).

Batchdyrking utføres i mange bransjer basert på den vitale aktiviteten til mikroorganismer. Ulempen med periodisk dyrking er den irrasjonelle tiden brukt på å gå gjennom alle fire stadier av avlingens utvikling, og perioden med den mest aktive livsaktiviteten - den logaritmiske vekstfasen - opptar en liten del av produksjonssyklusen.

I løpet av de siste tretti årene har en mer progressiv metode for kontinuerlig dyrking av mikroorganismer blitt stadig viktigere, som består i å plassere kulturen i et spesielt apparat hvor ferskt næringsmedium hele tiden strømmer inn og kulturvæsken fjernes med samme hastighet. Frøet dyrkes til det logaritmiske vekststadiet og tilsettes til næringsmediet. Varigheten av perioden med logaritmisk vekst avhenger av mengden næringsstoffer i mediet, samt mengden av skadelige metabolske produkter frigjort av cellen.

Med høy tilstrømningshastighet fornyes miljøet raskt, næringsstoffer rekker ikke å samle seg og kulturen opprettholdes i aktiv tilstand så lenge som ønskelig, uten å nå dødsstadiet. Til tross for den betydelige maskinvarekompleksiteten teknologisk prosess, har den kontinuerlige dyrkingsmetoden flere fordeler i forhold til batchmetoden.

I i fjor en metode for kontinuerlig dyrking av mikroorganismeceller i immobilisert (vedlagt) tilstand - på filmer, granulat, fibre av spesielt utvalgte syntetiske polymermaterialer. Immobiliserte mikrobielle celler fungerer gjentatte ganger og opprettholder høy biokjemisk aktivitet i lang tid.

Kontinuerlig dyrking er svært lovende og er mye brukt i næringsmiddel- og mikrobiologiske industrier og skaper muligheten for automatisk å opprettholde spesifiserte optimale forhold, og dermed sikre standardisering av det ferdige produktet til lavest mulig kostnad.

76. Hvorfor er den volumetriske toppingsmetoden for dyrking interessant?

Når en del av volumet fra bioreaktoren fjernes fra tid til annen når et tilsvarende volum medium tilsettes. Dette fører til regelmessig foryngelse av kulturen og en forsinkelse i overgangen til den døende fasen.

77. Hvorfor er fôringsmetoden for dyrking interessant?

I tillegg til å introdusere et næringssubstrat i reaktoren før en biologisk gjenstand innføres i den, tilsettes næringsstoffer til apparatet under dyrkingsprosessen med visse intervaller i porsjoner eller kontinuerlig "dråpe for dråpe". Noen ganger introduseres et biologisk objekt i tillegg.

78. Hvorfor er dialysemetoden for dyrking interessant?

Næringssubstratet kommer hele tiden inn i reaktoren gjennom en spesiell membran. Dialyse fører til en reduksjon i konsentrasjonen av celleavfallsprodukter som påvirker deres levedyktighet negativt.

79. Hvordan fungerer en fortrengningsfermentor?

Et åpent fortrengningssystem skiller seg fra et ideelt blandesystem ved at kulturen i det ikke er blandet, men er en væskestrøm gjennom et rør. Det vanligste dyrkingsapparatet i dette tilfellet er en rørformet fermentor. Dette prinsippet kan brukes under gjæringsstadiet av ølproduksjon.

80. Hvordan fungerer en fullfortrengningsfermentor?

Disse inkluderer turbostater og pH-statistikk. Kulturen er blandet inn i det.

81. Hvordan reguleres kjemostatika og turbidostatika?

Kjemostat - tilførselen av næringsmedium reguleres av celletetthet Den styres direkte: strømningshastigheten stilles inn og biomassekonsentrasjonen justeres til den.

Turbidostat – regulert av celletetthet, kontrollert etter prinsippet tilbakemelding: Strømningshastighet avhenger av nødvendig cellebiomassekonsentrasjon ved utløpet.

82. Befolkningsvekstkurve under periodisk dyrking, som indikerer vekstfaser.

EN) etterslep fase- relativt langsom vekst av den introduserte avlingen, utvikler et nytt habitat i bioreaktoren; b) eksponentiell fase- rask celledeling, balansert kulturvekst; V) langsom vekstfase assosiert med uttømming av næringssubstrater og akkumulering av giftige metabolske produkter; G) stasjoner fase- cellevekst er lik tapet deres; d) døende fase- gradvis nedgang i antall levedyktige celler.

83. Hvordan redusere etterslepfasen i produksjonen.

Lagfasen forkortes (eller kan være helt fraværende) hvis aktive unge celler fra den eksponentielle vekstfasen overføres til ferskt medium med samme sammensetning og temperatur.

84. Hva er forskjellen mellom generasjonstid og biomassedoblingstid.

Generasjonstid er perioden med celledobling.

Doblingstid er perioden som kreves for å doble biomassen.

Eksempel: for planter: generasjonstid - 20-70 timer

Doblingstid – 1-2 uker

85. Formel for absolutt vekstrate.

Økning i antall celler over en viss tidsperiode.

86. Spesifikk vekstrate (to formler).

µ-spesifikk veksthastighet (cellevekst per time)

µ=V/x utfall= dx/dt * 1/x

µ=2,3(log X – logXo)/t1-t2

87. Klassifisering av kontinuerlige dyrkingssystemer.

Åpen

A) homogent kontinuerlig

-enkelt trinn

- flertrinns

en enkel

b) kompleks

B) heterogen - kontinuerlig

- rørformet

- motstrøm

2) stengt ( mekanisk celledeteksjon)

A) 100 % resirkulering

B) vekst i interfase

88. I hvilke systemer etableres en mobil likevektstilstand? (Jeg kunne ikke finne nøyaktig hvilke systemer, bare likhet)

µ= dx/dt*1/x eller dx/dt = µ*b betingelse for kontinuerlig dyrking, kompenseres den øyeblikkelige økningen i biomasse ved fjerning av biomasse fra miljøet (Dx), dvs. µx –Dx=0 eller (µ -D)*x=0, hvorfra D=µ, denne likheten er hovedbetingelsen for å opprettholde likevekt.

89.Hvordan fungerer rørformede fermentorer?

Rørformet gjæringsbeholder(gassløft) består av en reaktor av skall-og-rør-type, gjennom hvilken væsken beveges av en luftstrøm til den øvre delen av apparatet og, når den kommer inn i separatoren, returnerer til reaktoren, hvor den igjen blir medført i luft, og dermed sirkuleres.

90. Hvordan motstrømsfermentorer fungerer.

Boblegjæringsapparater. Luft tilføres dem gjennom borbatterier, som er plassert i den nedre delen av

Dyrking av mikroorganismer er en av hovedmetodene for mikrobiologi. Suksessen til studiet og praktisk anvendelse avhenger i stor grad av evnen til å dyrke mikroorganismer under laboratorieforhold. Dyrking er basert på kunnskap om mikroorganismers fysiologiske og biokjemiske egenskaper og forståelse for betydningen av fysiske og kjemiske miljøforhold for deres livsaktivitet.

PRINSIPPER FOR SAMLING AV MEDIER FOR DYRKING AV MIKROORGANISMER

Under laboratorieforhold dyrkes mikroorganismer på næringsmedier, så næringsmediet må inneholde alle stoffene som er nødvendige for deres vekst. Hundrevis av forskjellige medier er foreslått for dyrking av mikroorganismer, hvis sammensetning bestemmes av behovene til mikroorganismer for forbindelser som er nødvendige for biosyntese og energiproduksjon. De konstruktive og energiske prosessene til mikroorganismer er ekstremt forskjellige, og derfor er deres ernæringsmessige behov like forskjellige. Fra dette det følger at det ikke finnes noen universelle medier som er like egnet for vekst av alle mikroorganismer uten unntak.

Hovedkomponentene i ethvert næringsmedium for dyrking av mikroorganismer er karbon- og nitrogenforbindelser. OG Det er disse forbindelsene som bestemmer spesifisiteten til de aller fleste næringsmedier.

Basert på deres karbonbehov deles mikroorganismer vanligvis inn i to store grupper - autotrofer og heterotrofer.

Autotrofe mikroorganismer er i stand til å bruke karbondioksid, en forbindelse som inneholder karbon i sin mest oksiderte form, som den eneste kilden til karbon. I samsvar med dette, når man dyrker autotrofer, er det nødvendig å forsyne cellene med karbondioksid, siden konsentrasjonen av karbondioksid i luften ikke overstiger 0,03% og dens inntreden i miljøet gjennom diffusjon ikke er nok for intensiv vekst av mikroorganismer . Derfor tilsettes natriumbikarbonat (NaHC) eller karbonater, oftest kalsiumkarbonat (CaC), til mediet for dyrking av autotrofer. I noen tilfeller blåses luft som er kunstig anriket med 1-5 % karbondioksid gjennom mediet.

Behovene til heterotrofe mikroorganismer kan ikke bare tilfredsstilles med karbondioksid. For deres utvikling må miljøet inneholde organiske forbindelser. Avhengig av deres individuelle egenskaper, er heterotrofe mikroorganismer i stand til å bruke forskjellige karbonforbindelser - syrer, alkoholer, karbohydrater, hydrokarboner, aromatiske forbindelser. Samtidig trenger noen mikroorganismer, for eksempel en rekke bakterier fra familien Pseudotonadaceae, kan nøye seg med et bredt spekter av ulike organiske stoffer, mens andre mikroorganismer kjennetegnes av høy spesialisering og evne til å bruke kun noen få karbonforbindelser.Derfor bruker noen metanoksiderende bakterier kun metan og metanol.

Den andre hovedkomponenten i vekstmediet er nitrogenkilden. Nitrogen er en del av de organiske stoffene i cellen hovedsakelig i redusert form - i form av amino (-N) eller imino (-NH) grupper. Likevel kan mikroorganismers behov for en nitrogenkilde dekkes av ulike nitrogenholdige forbindelser hvor nitrogen har ulik grad av reduksjon. For mange mikroorganismer kan dette være ammoniumsalter. I dette tilfellet tilsettes NCl eller (N)S til mediet. Det bør imidlertid huskes at ammoniumsalter er fysiologisk sure salter, siden når ammoniumionet brukes, akkumuleres anionet til den tilsvarende syren i mediet. Dette fører til en merkbar økning i surheten i miljøet og kan påvirke utviklingen av mikroorganismer negativt. Ammoniumhydroksid (NNOH) brukes sjelden som nitrogenkilde, siden det forårsaker sterk alkalisering av næringsmedier.

Nitrogenbehovet til et betydelig antall mikroorganismer kan dekkes av nitrater. Næringsmedier for dyrking av slike mikroorganismer inneholder KNO eller NaNO. I motsetning til ammoniumsalter, er nitrater fysiologisk alkaliske salter, siden når NO-anionet brukes, akkumuleres K+ eller Na+ kationer i mediet. Nitritt er giftig for mange mikroorganismer i sure forhold, så de brukes nesten aldri som nitrogenkilde.

Næringsmedier for dyrking av mikroorganismer som er mer krevende for nitrogen og som følgelig har lavere biosyntetiske evner, må inneholde en, flere eller et komplett sett med aminosyrer. Individuelle aminosyrer i L- eller DL-form tilsettes det sterile mediet i en konsentrasjon på 0,1 til 0,05 g per 100 ml umiddelbart før det inokuleres med mikroorganismer. For å gjøre dette anbefales det å bruke aminosyreløsninger der konsentrasjonen overstiger aminosyreinnholdet i mediet med 100 ganger. Glycin, alanin, prolin, lysin og ornitin løses i destillert vann, fenylalanin og tryptofan løses i destillert vann, alkaliseres med NaOH, og de resterende aminosyrene løses i destillert vann, surgjort med HCl. Aminosyrer - cystin og cystein, samt amider - glutamin og asparagin er ustabile mot varme, så de steriliseres ved filtrering. De resterende aminosyrene kan steriliseres ved 0,5 atm i 15 minutter.

Mikroorganismers behov for flere aminosyrer dekkes ofte ved å tilsette proteinhydrolysat til mediet. For å oppnå hydrolysater brukes proteiner av animalsk opprinnelse (kjøtt, fisk, gelatin, kasein) eller plante (soyabønner, solsikkefrø), samt mikrobielle celler (gjær, alger, bakterier). Hydrolyse utføres ved bruk av proteolytiske enzymer eller ved koking med mineralsyrer eller tertealkalier. Sammensetningen av hydrolysater er ikke den samme og avhenger av det opprinnelige substratet, samt fremstillingsmetoden. Oftest brukes kaseinhydrolysat, som fremstilles i laboratoriet, vanligvis ved syrehydrolyse. For å gjøre dette helles 20 g kasein i 200 ml vann, 10 ml konsentrert HSO tilsettes og holdes i en autoklav i 4 timer ved 1,5 atm. Dette forårsaker imidlertid korrosjon av autoklavutstyret, så kaseinhydrolysat oppnås ofte annerledes. Til 200 g kasein tilsett 280 ml 6N HCl-løsning, og blandingen tilbakeløpskokes i 18 h. Det resulterende hydrolysatet nøytraliseres med en 50% NaOH-løsning til pH 7, filtreres; gjennom et papirfilter og sterilisert ved 0,5 atm i 30 minutter. Innholdet av aminnitrogen i hydrolysatet oppnådd på denne måten er 700 - 1000 mg per 100 ml. Det tilsettes til mediet i slike mengder at konsentrasjonen av aminnitrogen er 10-30 mg per 100 ml. Det bør man ha i bakhodet Under sur hydrolyse blir tryptofan fullstendig ødelagt, cystein blir ødelagt i ganske stor grad, og serin og treonin blir litt ødelagt. Det er et ferdig preparat av kaseinhydrolysat. Det tilsettes til medier fra 0,1 til 1,0 g per 100 ml, avhengig av behovene til mikroorganismer.

De mest krevende mikroorganismene dyrkes på næringsmedier som inneholder proteiner eller produkter av deres ufullstendige nedbrytning - peptoner. Peptoner er en blanding av poly- og oligopeptider, aminosyrer, organiske nitrogenbaser, salter og sporstoffer. De oppnås som et resultat av virkningen av proteolytiske enzymer på proteiner av animalsk (muskelprotein, kasein) eller vegetabilsk (soyamel) opprinnelse. I innenlandske laboratorier brukes det enzymatiske peptonet produsert av Semipalatinsk-anlegget oftest. Det er et lysegult hygroskopisk pulver farger, fullstendig løselig i vann; En 1% løsning av pepton har en nøytral eller svakt sur reaksjon. Pepton tilsettes til næringsmedier fra 1-2 til 20 g per 1 liter.

Det må tas i betraktning at mikroorganismer kan bruke aminosyrer og pepton ikke bare som en nitrogenkilde, men også som en kilde til karbon og energi.

Noen bakterier er i stand til å bruke molekylært nitrogen - N - som eneste nitrogenkilde.Dette er nitrogenfiksere. Nitrogenforbindelser kan ikke tilsettes media for dyrking av slike mikroorganismer. Nitrogenfiksere tilføres nitrogengass gjennom kontakt av mediet med luft eller dyrking i nitrogenatmosfære.

I tillegg til kilder til karbon og nitrogen, krever mange mikroorganismer tilstedeværelsen i miljøet av såkalte vekstfaktorer, som inkluderer vitaminer, puriner, pyrimidiner og aminosyrer. For å understreke behovet for mikroorganismer for vekstfaktorer, er det vanlig å bruke begrepene "prototrofer" og "auxotrofer". Prototrofer trenger ikke vekstfaktorer; for auxotrofer er tilstedeværelsen av en eller flere vekstfaktorer i miljøet helt nødvendig. Disse begrepene er spesielt mye brukt i genetikklitteraturen. Hvis behovene til mikroorganismer for vekstfaktorer begrenses av ett eller flere vitaminer, anbefales det å legge dem til kulturmediet ved å bruke følgende konsentrasjoner: tiamin (vitamin B), Ca-pantotenat, riboflavin (vitamin B), nikotinsyre ( niacin), pyridoksin, pyridoksamin, kolin, kobalamin (vitamin B) - 1 mcg per 1 ml medium; folsyre og n-aminobenzosyre - 0,05 μg per 1 ml medium; biotin - 0,005 mcg per 1 ml medium.

Vitaminer tilsettes det sterile mediet umiddelbart før inokulering. For å gjøre dette anbefales det å bruke løsninger der konsentrasjonen av vitaminet overstiger innholdet i næringsmediet med 100 ganger. Løsninger tilberedes i sterile beholdere og sterilt destillert vann brukes. Unntakene er riboflavin og folsyre. Riboflavin oppløses i 0,02 N eddiksyre, og folsyre oppløses i 0,01 N NaOH, deretter justeres NaOH-konsentrasjon i løsning opp til 0,001 N. De resulterende løsningene steriliseres ved oppvarming i et kokende vannbad i 3 minutter. Det anbefales å sterilisere tiaminløsningen ved filtrering, siden tiamin ødelegges ved oppvarming. Ved en temperatur på +4 lagres vitaminløsninger i minst en måned. Løsninger folsyre. Pyridoksin og riboflavin oppbevares i mørket fordi de er lysfølsomme.

Eksempler på blandinger som inneholder vekstfaktorer inkluderer gjærekstrakt, gjærautolysat og maisekstrakt. Gjærekstrakt tilsettes til kulturmediet fra 0,05 opptil 0,5 g per 100 ml, gjærautolysat - i en slik mengde at konsentrasjonen av aminnitrogen er 5-30 mg per 100 ml medium. Gjærekstrakt

tilgjengelig for salg. Gjærautolysat tilberedes som følger: 40 g ferskpresset eller 10 g tørrgjær helles med vann og røres til en homogen masse er oppnådd, deretter tilsettes flere krystaller av tymol eller 1-2 ml kloroform og holdes i en termostat. ved 50-55 i 3 dager. I løpet av denne tiden dør gjærcellene, men enzymene forblir aktive og hydrolyserer proteiner, så vel som andre biopolymerer. Etter 3 dager blir det resulterende autolysatet, etter grundig blanding, kokt over lav varme i 20 minutter og filtrert gjennom papirmasse ved bruk av en Buchner-trakt. Amin-nitrogeninnholdet bestemmes ved formell titrering. Gjærautolysatet steriliseres ved 0,5 atm i 15 minutter og oppbevares i kjøleskap.

Maisekstrakt er et ferdig produkt fra stivelses- og sirupindustrifabrikker. Den inneholder aminosyrer, vitaminer, en ganske stor mengde organiske syrer (melkesyre, eddiksyre og maursyre) og mineralsalter. Maisekstrakt tilsettes til mediet fra 0,5 til 5 g per 10 ml; sterilisert ved 0,5 atm.

I tillegg til kilder til karbon, nitrogen og vekstfaktorer, trenger mikroorganismer svovel, fosfor og en rekke andre grunnstoffer for å bygge cellestoffer. Alle av dem må være inneholdt i et næringsmedium i en form som er tilgjengelig for mikroorganismer. Behovene til ulike grupper av mikroorganismer for svovel, fosfor og andre askeelementer dekkes vanligvis av mineralsalter. Derfor kan den såkalte "mineralbakgrunnen" til medier for dyrking av mange mikroorganismer være lik sammensetning. Således tilfredsstilles de aller fleste mikroorganismers behov for svovel av sulfater, selv om svovel i cellen hovedsakelig finnes i redusert form, i form av sulfhydrylgrupper. Mikroorganismer som krever tilstedeværelse av redusert svovel i miljøet er mye mindre vanlige. I dette tilfellet tilsettes sulfider, oftest NaS, eller organiske forbindelser som inneholder sulfhydrylgrupper, slik som cystein, til mediet.

Fosforsyresalter tilfredsstiller fosforbehovet til mikroorganismer. Alle nødvendige metaller - K, Na, Ca, Mg, Fe, Mn, Co, Cu - og andre elementer oppnås av mikroorganismer i form av kationer eller anioner av uorganiske salter. For eksempel er magnesiumkilden MgSO, kilden til natrium og klor er NaCl, kalsium er CaCO eller CaCl. Jern tilsettes medier i form av klorid, sulfat eller sitrat.

For å unngå utfelling som følge av dannelse av uløselige fosfatkomplekser med enkelte kationer, spesielt jern og kalsium, anbefales det å tilsette 0,001 til 1 g/l etylendiamintetraacetat (EDTA) eller natriumheksametafosfat i en konsentrasjon på 4 g/l til media. Kompleksene dannet av disse forbindelsene med kationer tjener som en reserve hvorfra frie kationer kommer inn i løsningen som et resultat av dissosiasjon.

Kalium, magnesium, kalsium og jern kreves i relativt store mengder, derfor er deres salter vanligvis inkludert i næringsmedier. Mikroorganismers behov for mangan, molybden, sink, kobber og kobolt er svært små. Disse elementene, ofte kalt mikroelementer, tilsettes medier fra 1 mg opptil l µg per 1 liter; høyere konsentrasjoner kan være giftig. Næringsmedier med pepton, jordekstrakt, gjærekstrakt, kaseinhydrolysat inneholder de nødvendige mikroelementene. De bør tilsettes syntetiske medier tilberedt med destillert vann. Lite er kjent om de optimale konsentrasjonene av mikroelementer for forskjellige mikroorganismer; derfor er blandinger av mikroelementer med forskjellige sammensetninger foreslått.

Blanding av mikroelementer ifølge Drews (Drews, 1976), mg: EDTA Na-800; MnCl*4HO-10; CoCl*6HO-4; CuSO-1; NaMoO*2HO-3;ZnCl-2; LiCl - 0,5; SnCl*2H0; - 0,5; NVO - 1, KVg-2; KJ -2; BaCl-0,5; destillert vann - 1000 ml; pH 6,0. Tilsett 5 til 10 ml av denne løsningen per 1 liter medium.

Blanding av mikroelementer ifølge Pfennig (Pfennig, 1965), mg: EDTA-500; FeSO*7HO-200; ZnSO*7HO-10; MnCl.4HO-3; HBO-30 ; CoCl*2HO - 20 ; CuCl*2HO - 1; NiCl*6HO - 2; NaMoO*2HO - 3; destillert vann - 1000 ml. Tilsett fra 1 til 10 ml per 1 liter medium denne løsningen. Det anbefales å sterilisere løsninger av mikroelementer separat og legge dem til mediet umiddelbart før det inokuleres.

Næringsmedier for dyrking av mikroorganismer må i tillegg til de forbindelsene som er nødvendige for biosynteseprosesser også inneholde energimateriale. I henhold til metoden for å skaffe energi er alle mikroorganismer vanligvis delt inn i to hovedgrupper: kjemotrofer og fototrofer.

Kjemotrofer bruker energien til oksidasjon av forskjellige forbindelser. Avhengig av det oksiderte substratet (hydrogendonor), skilles kjemolitotrofer og kjemoorganotrofer mellom kjemotrofe organismer. Førstnevnte oksiderer uorganiske forbindelser som HS, S eller andre ufullstendig oksiderte svovelforbindelser, H, NH+, NO- eller Fe. Disse forbindelsene i medier for dyrking av kjemolitotrofe bakterier utfører primært funksjonen som energimateriale. For kjemoorganotrofer er energisubstratet organiske stoffer, som vanligvis spiller en dobbel rolle, og er både en kilde til karbon og en energikilde. Imidlertid er det mikroorganismer som krever forskjellige forbindelser for konstruktive og energiske prosesser. For eksempel henter homofermentative melkesyrebakterier energi fra fermentering av sukker, men bruker dem nesten ikke i biosynteseprosesser. For konstruktive formål trenger de ferdige aminosyrer, purin- eller pyrimidinbaser og vitaminer.

Fototrofer bruker lysenergi. For å dekke energibehovet til disse bakteriene, dyrkes de under dagslys eller kunstig lys.

Basert på sammensetning er det vanlig å skille mellom naturlige eller naturlige medier med usikker sammensetning og syntetiske medier.

Naturlig vanligvis referert til som medier som består av produkter av animalsk eller vegetabilsk opprinnelse. Slike medier inkluderer grønnsaks- eller fruktjuicer, animalsk vev, fortynnet blod, melk, sjøvann, innsjøer og mineralkilder, avkok eller ekstrakter hentet fra naturlige substrater som kjøtt, jord, gjødsel, ulike deler av planter og mikrobielle celler.

Mange mikroorganismer utvikler seg godt på naturlige medier, siden slike medier inneholder alle komponentene som er nødvendige for vekst og utvikling. Disse mediene har imidlertid en kompleks, varierende kjemisk sammensetning og er til liten nytte for å studere metabolismen av mikroorganismer, siden det er vanskelig å ta hensyn til forbruket av en rekke komponenter og dannelsen av metabolske produkter. Naturlige medier brukes hovedsakelig for å opprettholde mikrobielle kulturer, akkumulere biomasse og til diagnostiske formål. Naturlige medier som er mye brukt i laboratoriepraksis inkluderer kjøtt-peptonbuljong, uhumlet ølurt, gjær- og potetmedier og jordekstrakt.

Kjøtt - peptonbuljong (MPB). Grunnlaget for tilberedning er kjøttvann, som vanligvis tilberedes på følgende måte: 500 g kjøtt, fri for bein, fett og sener, finhakkes eller føres gjennom en kjøttkvern, helles i 1 liter vann fra springen og etterlates i rommet temperatur i 12 timer eller i en termostat på tretti i 6 timer, og ved 37 - i 2 timer I løpet av denne tiden ekstraheres forskjellige stoffer fra kjøttet, inkludert vannløselige vitaminer. Deretter presses kjøttet gjennom osteduk, og den resulterende infusjonen kokes i 30 minutter. I dette tilfellet koagulerer proteiner. Den avkjølte massen filtreres gjennom et bomullsfilter og tilsettes vann til det opprinnelige volumet. TIL 1 % pepton og 0,5 % NaCl tilsettes kjøttvann.

MPB er et rikt næringsmedium, men det inneholder nesten ingen karbohydrater. Om nødvendig tilsettes de til MPB oftest i en mengde på 1-2 g per 100 ml. MPB steriliseres ved 1 atm.

Malt (uhumlet øl) vørter er et godt miljø for noen melke- og eddiksyrebakterier, gjær, mikroskopiske sopp og andre representanter for heterotrofe mikroorganismer. Hovedkomponentene i vørteren er karbohydrater (opptil 90% av den totale massen av den tørre resten) og nitrogenholdige forbindelser (opptil 6-7% av den totale massen av den tørre resten). Av karbohydratene inneholder de største mengdene maltose og dekstriner. Vørteren inneholder vitaminer, hovedsakelig gruppe B, organiske syrer og mineralsalter.

Vørteren tilberedes som følger. 250 g malt malt helles i 1 liter vann fra springen, varmes opp til 48 - 50 grader og holdes ved denne temperaturen i en halv time, mens blandingen røres kontinuerlig for å unngå klumper. I løpet av den neste halvtimen heves temperaturen til 55-58 °C og holdes på dette nivået til stivelsen er fullstendig forsukket, det vil si til reaksjonen av den avkjølte blandingen med jod er negativ. I denne modusen forekommer også hydrolyse av proteiner til aminosyrer og peptider. Det resulterende ekstraktet filtreres gjennom papirmasse eller bomullsull. Konsentrasjonen av sukker i filtratet bestemmes ved hjelp av et Balling-hydrometer, hvorav grader (B) omtrent tilsvarer prosentandelen sukker i vørteren. Vørteren bringes til ønsket styrke med vann fra springen. For dyrking av mikroskopiske sopp brukes oftest 3-4B vørter, for gjær - 6-8B, og for de mest krevende melkesyrebakteriene - 8-12B vørter. Vørteren steriliseres ved 0,5 atm i 30 minutter.

Gjærmedium brukes hovedsakelig til å dyrke en rekke heterotrofe mikroorganismer. Grunnlaget for gjærmediet er gjærvann. For å tilberede det kokes 70 - 100 g ferskpresset eller 7 - 10 g tørrgjær i 1 liter vann i 30 minutter og etter at gjærcellene har satt seg, dekanteres væsken eller filtreres gjennom bomullsull. Tilsett 1 liter vann til filtratet, kok opp igjen i 30 minutter og filtrer igjen. Til 100 ml av det resulterende gjærvannet tilsett 1-2 g karbohydrater og mineralsalter, oftest KHPO (0,1 g) og NaCl (0,5 g). Juster pH til mediet til 6,8-7,2. Mediet steriliseres ved 0,5 atm i 20 - 30 minutter.

Potetmedium brukes hovedsakelig til å dyrke sporedannende bakterier, representanter for slekten Caulobacter og noen andre kjemoorganotrofe bakterier. For å forberede dette mediet, kutt 200 g grundig vaskede og skrellede poteter i små skiver, tilsett 1 liter vann fra springen og kok i 20 - 30 minutter. Buljongen filtreres gjennom bomullsull, volumet av filtratet justeres til 1 liter og helles i kar for dyrking. Mediet steriliseres i 1 time ved 1 atm eller 30 minutter ved 1,5 atm.

Jordekstrakt brukes hovedsakelig til å dyrke forskjellige representanter for jordmikroflora. For å forberede den helles 500 g fruktbar jord i 1,5 liter vann fra springen og autoklaveres ved 1 atm i 30 minutter. Det resulterende ekstraktet filtreres gjennom et papirfilter, 0,5 g CaCO tilsettes til det varme filtratet, blandes grundig og filtreres igjen etter 5-7 minutter. Som regel tilsettes 0,2 g KHPO til ekstraktet for hver 1000 ml. Steriliser ved 1 atm.

Syntetiske medier- dette er medier som kun inneholder forbindelser av en viss kjemisk sammensetning, tatt i nøyaktig spesifiserte mengder. Syntetiske medier er mye brukt i studiet av metabolisme, fysiologi og biokjemi av mikroorganismer. For å utvikle sammensetningen av syntetiske medier som sikrer vekst av mikroorganismer eller forbedret biosyntese av ethvert avfallsprodukt, er det nødvendig å kjenne til de metabolske egenskapene til en gitt organisme og dens behov for matkilder. For tiden har mikrobiologer til rådighet et tilstrekkelig antall syntetiske medier som ikke er dårligere i kvalitet enn naturlige medier med usikker sammensetning. Syntetiske medier kan ha et relativt stort sett med komponenter, men kan også være ganske enkle i sammensetningen. Oppskrifter for noen syntetiske medier er gitt i vedlegget.

Sammen med naturlige og syntetiske medier finnes det såkalte halvsyntetiske medier. Hovedkomponentene i semisyntetiske medier er forbindelser med kjent kjemisk sammensetning - karbohydrater, ammoniumsalter eller nitrater, fosfater, etc. Sammensetningen deres inkluderer imidlertid alltid stoffer med usikker sammensetning, som gjærautolysat, jordekstrakt eller kaseinhydrolysat. Disse mediene er mye brukt i industriell mikrobiologi for å oppnå aminosyrer, vitaminer, antibiotika og andre viktige avfallsprodukter fra mikroorganismer.

Det bør tas i betraktning at miljøer som sikrer god utvikling av mikroorganismer alltid er egnet til å løse andre forsknings- og praktiske problemer, siden ikke i alle tilfeller akkumulering av noe avfallsprodukt - et enzym, vitamin, antibiotika osv. går parallelt med akkumulering av biomasse.

Ofte, med rikelig vekst av mikroorganismer, dannes det ønskede metabolske produktet nesten ikke eller dannes i utilstrekkelige mengder. For å gi den nødvendige tilkoblingen i størst mulige mengder, brukes spesielle medier. Valget av konsentrasjonen og forholdet mellom komponentene i mediet utføres ved hjelp av metoder for matematisk planlegging av eksperimenter, som er beskrevet i tilstrekkelig detalj i boken av V. N. Maksimov (1980).

Valgfrie miljøer designet for å isolere mikroorganismer fra deres naturlige habitater. De sikrer hovedsakelig utviklingen av en viss gruppe mikroorganismer, som er preget av vanlige fysiologiske egenskaper. Les mer om i disse miljøene, se s. 108 - 109.

Differensialdiagnostiske (veiledende) miljøer gi

Evnen til raskt å skille en type mikroorganisme fra en annen andre eller identifisere noen av funksjonene deres. Et eksempel på et indikatormedium for å identifisere bakterier fra Escherichia coli-gruppen i naturlige substrater er Endo-agarmediet med følgende sammensetning, g: pepton-10; laktose-10; KHPO -3,5; NaHsO-2,5; agar - 150; destillert vann - 1000 ml; pH 7,4. 4 ml av en 10 % alkoholløsning av basisk fuchsin tilsettes til mediet. Mediet steriliseres ved 1 atm i 15 minutter og oppbevares mørkt. Bakterier fra slekten Escherichia på dette mediet danner de blodrøde kolonier med en metallisk glans.

Ved bestemmelse av bakteriearten brukes pH-indikatormedier, som inneholder en av indikatorene - nøytral rød (0,0005%), fenolrød (0,005%) eller bromtymolblå (0,0005%) . Hvis utviklingen av mikroorganismer er ledsaget av dannelse av syre eller alkali, endres fargen på indikatoren.Differensialdiagnostiske medier er spesielt mye brukt i sanitær og medisinsk mikrobiologi for rask identifisering av visse grupper av mikroorganismer.

Basert på deres fysiske tilstand skilles flytende, granulære og tette medier.

Flytende medier De er mye brukt for akkumulering av biomasse eller metabolske produkter, for å studere fysiologien og biokjemien til mikroorganismer, samt for å opprettholde og konservere i samlingen av kulturer av mikroorganismer som ikke utvikler seg godt på faste medier.

Massemedier brukes hovedsakelig i industriell mikrobiologi for dyrking av visse produsenter av fysiologisk aktive forbindelser, samt i samlinger for konservering av kulturer av mikroorganismer. Slike medier inkluderer for eksempel kokt hirse, kli, kvartssand dynket i en næringsløsning.

Tette medier brukes til å isolere rene kulturer, for diagnostiske formål for å beskrive kolonier, for å bestemme antall mikroorganismer, deres antibiotikaaktivitet, for å lagre kulturer i samlinger og i en rekke andre tilfeller. Agar eller gelatin brukes til å komprimere mediet. Silikatplater, som er impregnert med et næringsmedium, kan tjene som en tett base.

Figur 41. Klargjøring av agarskrå i reagensglass

Agar brukes spesielt ofte til å komprimere medier. Det er et komplekst polysakkarid som inneholder sukrose og agaropektin. I tillegg. Agar inkluderer en liten mengde lett assimilerte stoffer og ulike salter. Agar er hentet fra visse tang og kommer i form av tallerkener, stilker eller pulver. Agar er praktisk fordi de fleste mikroorganismer ikke bruker det som et substrat for vekst. I vann danner den en gel som smelter ved ca. 100°C og stivner ved 40°C.

Derfor kan en betydelig del av for tiden kjente mikroorganismer dyrkes på agarmedier.

Oftest tilsettes agar til media i en mengde på 1,5 %. Hvis det er nødvendig å oppnå et mer fuktig miljø, legg til 1,0%, og et tettere og tørrere miljø - 2-3% agar. Agarmediet varmes opp i et kokende vannbad til det smelter helt. Hvis det er meningen at mikroorganismer skal dyrkes på et skråstilt agarmedium i reagensglass, fylles hvert reagensglass med ikke mer enn 1/3 av mediet. For å forhindre at mediet tørker ut, klippes det etter sterilisering, før såing. For å gjøre dette settes reagensrør med et medium smeltet i et kokende vannbad i en skrå stilling (fig. 41) og mediet får stivne. Det skrå agarmediet skal ikke nå 4-6 cm opp til bomullspluggen Mediet beregnet for dyrking av bakterier i petriskåler helles i 20-25 ml rør med større volum enn for skråagarmediet, eller steriliseres i kolber. I sistnevnte tilfelle smeltes ikke agaren før sterilisering.

Når agarmediet avkjøles, dannes det kondensvann. Jo lavere konsentrasjon av agar, jo mer vann frigjøres. Derfor, når du dyrker mikroorganismer på overflaten av agarmedier i petriskåler, for å oppnå isolerte kolonier, plasseres skålene i en termostat med lokkene nede. Ellers akkumuleres kondens på innsiden av lokket, som, som strømmer på overflaten av mediet, forstyrrer produksjonen av isolerte kolonier.

Agar er lett alkalisk, så tilsetningen kan føre til en svak økning i pH. I svakt sure, nøytrale eller svakt alkaliske miljøer beholder agar evnen til å danne en gel etter flere sykluser med smelting og størkning og selv etter gjentatt sterilisering. Det må imidlertid huskes at når pH i mediet er under 5,5, hydrolyseres agar delvis under sterilisering og mister derfor evnen til å danne en gel, dvs. at den ikke stivner. I dette tilfellet steriliseres det separat fra mediet i et visst volum vann, smeltes i et vannbad og helles under konstant omrøring i et sterilt, forvarmet medium.

Agar, som nevnt ovenfor, inneholder urenheter av organiske og mineralske stoffer, som noen ganger er uønskede. For å bli kvitt de fleste av dem, fortsett som følger. Agaren fylles med vann fra springen og settes i en termostat på 30-37. Urenheter vaskes ut i vannet og brytes ned av mikroorganismene som utvikler seg i det. Etter en dag eller to tappes væsken, agaren vaskes flere ganger med ferskvann, fylles med vann igjen og settes tilbake i termostaten. Når dette vannet blir grumsete, erstattes det igjen med et nytt, og dette gjøres til lukten forsvinner og vannet slutter å bli grumsete. Vanligvis, etter 2-3 uker, oppnås agar som er nesten blottet for løselige organiske og mineralske stoffer. Vannet dreneres, agaren legges i en dobbel gasbindpose og vaskes med rennende vann fra springen i 2-3 dager, spres deretter utover i et tynt lag og tørkes i luft eller i ovn ved 40-50 grader.

Gelatin er et ekstrakt hentet fra substrater rike på kollagen - proteinet av bein, brusk, sener, skjell. Gelen dannet av gelatin smelter ved en temperatur på 25 ° C, som er lavere enn den vanlige inkubasjonstemperaturen for mange mikroorganismer (30 - 37 ° C). I tillegg blir gelatin flytende av proteolytiske enzymer, som mange mikroorganismer skiller ut i mediet. Disse egenskapene til gelatin begrenser bruken som komprimeringsmiddel. Gelatin brukes hovedsakelig til diagnostiske formål - for å påvise den proteolytiske aktiviteten til mikroorganismer , samt å få gigantiske og dype kolonier av gjær.I det første tilfellet bruker de kjøtt - pepton, i det andre - vørtergelatin.

10 - 20 % gelatin tilsettes flytende medium, får svelle i 5-10 minutter og varmes opp i vannbad til det er oppløst. Juster pH på mediet til 6,8-7,0 Gelatin er surt og har høy bufferkapasitet, så det brukes mer alkali til nøytralisering enn for eksempel til nøytralisering av MPA. Gelatinmedier steriliseres ved 0,5 atm i 15 minutter eller fraksjonert - 3 ganger i 20 minutter i en Koch-kjele. Gjentatt sterilisering av gelatinmedier, spesielt når mediets pH er under 6,0 eller over 7,3, anbefales ikke, siden gelatin er delvis hydrolysert og mister sine geldannende egenskaper.

Silikagel (silikagel) brukes som en fast base for syntetiske medier med strengt definert sammensetning.

Gelen fremstilles som følger. Til saltsyretetthet

1.1 tilsett under omrøring et likt volum flytende glassoppløsning (NaSiO eller KSiO) med samme tetthet Blandingen helles i petriskåler, 20-30 ml hver, og skålene står på en horisontal overflate i flere timer til det dannes en kiselsyregel. Når gelen blir tett, legges de åpne koppene i en glass- eller emaljebeholder, vaskes i 2-3 dager med rennende vann for å fjerne klorider, og deretter flere ganger med varmt destillert vann. Fraværet av klorider bedømmes av en kvalitativ prøve av vaskevann med en 1 - 5% løsning av sølvnitrat: i nærvær av klorider dannes et hvitt bunnfall. Platene, vasket fra klor, dynkes i 2-3 ml av et konsentrert medium, hvor innholdet av komponenter er 5-10 ganger høyere enn i det tilsvarende flytende mediet. Deretter plasseres koppene med gelplater åpne i et tørkeskap og tørkes ved 50-60, pass på at gelen ikke sprekker og overflaten forblir fuktig. Om nødvendig pakkes koppene inn i papir og, uten å snu, steriliseres i autoklav ved 0,5 atm i 15 minutter. Plater beregnet for å isolere og dyrke autotrofe bakterier trenger ikke steriliseres. Bare mediet som gelen er impregnert med steriliseres. Kopper med silikagelplater oppbevares under vann frem til bruk.

Noen spesifikke egenskaper ved agar, gelatin og kiselsyregel er oppsummert i tabell 3.

Tabell 3.-Hovedtrekk ved stoffer som brukes til å komprimere næringsmedier

Det bør huskes at alle medier med agar eller gelatin skal klassifiseres som naturlige medier med ubestemt sammensetning.

Avklaring av media. Klarte agar- eller gelatinmedier er nødvendig for noen spesielle studier, for eksempel for å oppnå godt synlige isolerte kolonier av anaerobe mikroorganismer.

I noen tilfeller kan et gjennomsiktig medium være oppnå ved å filtrere det fra sedimentet gjennom absorberende bomullsull. Når dette ikke er nok, avklares mediene ved hjelp av eggehviter. For å lette 500 ml Hviten i ett egg er tilstrekkelig. Hviten skilles fra eggeplommen og ristes med et like stort volum vann til det dannes et fast skum. Det piskede proteinet helles i et tidligere smeltet og avkjølt til 45-50 medium. Før du tilsetter protein, kontroller pH og om nødvendig alkaliser mediet til pH 7,0-7,3. Mediet med proteinet blandes grundig og varmes opp til 100°C i en autoklav eller i en Koch-kjele i en time. Proteinet koagulerer og adsorberer alle partikler suspendert i mediet. Når det koagulerte proteinet stiger til overflaten eller synker ned, filtreres mediet raskt varmt gjennom bomullsull. I dette tilfellet er det praktisk å bruke spesielt oppvarmede støtter for trakter, som forhindrer at mediet størkner under filtrering.

Syntetiske agarmedier, som det er uønsket å tilsette protein i, er klargjort som følger. Mediet helles i et beger, autoklaveres og etter sterilisering i lukket autoklav i 10-12 timer, vanligvis over natten. Med en slik langsom avkjøling legger alle suspenderte partikler seg til bunnen. Det frosne agarmediet fjernes fra glasset, den øvre, gjennomsiktige delen kuttes av, legges i en kolbe og steriliseres igjen.

Retter beregnet for tilberedning av medier og dyrking av mikroorganismer må ikke inneholde fremmedstoffer. Det er best å bruke glassbeholdere. Ny glassvarer vasket og senket over natten i en 1-2% løsning av saltsyre eller svovelsyre, deretter vasket flere ganger med vann og tørket. Noen ganger krever arbeid med mikroelementer, vitaminer, syntetiske og andre medier spesielt grundig rengjøring av oppvasken. Naturlige medier med usikker sammensetning kan tilberedes i emaljeretter.

Du bør ikke tilberede store lager med media for fremtidig bruk, da de tørker ut, konsentreres og blir ubrukelige. Oppbevar mediet på et kjølig sted, beskyttet mot lys og ikke for fuktig. Under fuktige forhold blir bomullsplugger mettet med fuktighet og mycelet av mikroskopiske sopp kan vokse gjennom dem. Hvert kar med mediet må ha en etikett som angir sammensetningen (navnet) på mediet og tidspunktet for tilberedning.

Et universelt verktøy for produksjon av avlinger er en bakteriell løkke. I tillegg til dette brukes en spesiell bakterienål for inokulering ved injeksjon, og metall- eller glassspadler brukes til inokulering på petriskåler. For avlinger flytende materialer Sammen med løkken brukes Pasteur og graderte pipetter. De første er ferdiglaget av sterile lavtsmeltende glassrør, som trekkes på en flamme i form av kapillærer. Enden av kapillæren forsegles umiddelbart for å opprettholde sterilitet. For Pasteur og graderte pipetter er den brede enden dekket med bomullsull, hvoretter de plasseres i spesielle tilfeller eller pakkes inn i papir og steriliseres.

Ved gjensåing av en bakteriekultur ta et reagensrør inn i venstre hand, og med høyre hånd, ta tak i bomullspluggen med fingrene IV og V, fjern den og bær den over brennerflammen. Hold løkken med de andre fingrene på samme hånd, bruk den til å samle podestoffet, og lukk deretter reagensrøret med en propp. Deretter føres en løkke med inokulum inn i reagensrøret med den skrå agaren, senker den til kondensatet i den nedre delen av mediet, og materialet fordeles i en sikksakkbevegelse over den skrå overflaten av agaren. Etter å ha fjernet løkken, brenn kanten av reagensrøret og lukk det med en propp. Sløyfen steriliseres i en brennerflamme og plasseres på stativ. Reagensglass med kulturer er skrevet over d, og angir dato for såing og arten av inokulum (testnummer eller navn på kulturen).

Såing med plen produsert med en slikkepott på næringsagar i en petriskål. For å gjøre dette, åpne lokket litt med venstre hånd og påfør frømateriale på overflaten av næringsagaren ved hjelp av en løkke eller pipette. Før deretter spatelen gjennom brennerflammen, avkjøl den på innsiden av lokket og gni materialet over hele overflaten av mediet. Etter inkubering av inokuleringen vises jevn kontinuerlig vekst av bakterier.

For at en kultur av mikroorganismer skal vokse, formere seg og utføre biosyntesen av ethvert stoff normalt, er gunstige miljøforhold nødvendig. Under ugunstige forhold endres egenskapene til mikroorganismer, deres vitale aktivitet undertrykkes eller død inntreffer. Under ugunstige forhold endres egenskapene til mikroorganismer, deres vitale aktivitet undertrykkes eller død inntreffer.

Fysisk– temperatur, miljøfuktighet, næringskonsentrasjon.

Til kjemiske faktorer som påvirker livsaktiviteten til mikroorganismer inkluderer: pH i miljøet, redokspotensial (rH2) og tilstedeværelsen av giftige stoffer i miljøet.

Biologiske faktorer – komme ned til forholdet mellom mikroorganismer som kommer i kontakt under deres livsaktivitet.

Bakteriers kulturelle egenskaper– ernæringsbehov, vekstforhold og vekstmønster for bakterier på bakterier. miljøer I ernærings-, nitrogen- og vekstfaktorer, bakteriers evne til å vokse på visse næringsmedier, under vekstforhold - pH, Eh, O2-konsentrasjon, tetthet, mediets osmotisk trykk, veksttemperatur; i vekstens natur - veksthastigheten (rask, sakte), utseendet til produktet i flytende, faste og halvflytende medier, endringene som skjer i mediet eller dets individuelle komponenter under veksten av mikrober. Informasjon om K.s. brukes ved valg av dyrkingsmetoder og ved identifisering av den isolerte planten

30. Prinsipper og metoder for isolering av rene kulturer av aerobe og anaerobe bakterier.

En ren kultur er en populasjon av bakterier av én art eller én variant dyrket på et næringsmedium. Mange typer bakterier er delt inn etter en egenskap i biologiske varianter - biovars (syn: biotyper). Biovarer som er forskjellige i biokjemiske egenskaper kalles kjemovarer, i antigene egenskaper - serovarer, og i følsomhet for fag - phagevars. Kulturer av mikrober av samme art, eller biovar, isolert fra forskjellige kilder eller til forskjellige tider fra samme kilde kalles stammer, som vanligvis er betegnet med tall eller noen symboler. Rene kulturer av bakterier i diagnostiske bakteriologiske laboratorier oppnås fra isolerte kolonier ved subkultur med en løkke inn i et reagensrør med et fast eller, mindre vanlig, flytende næringsmedium.

En koloni er en isolert opphopning av bakterier av én art, eller biovar, dyrket på et tett næringsmedium som et resultat av multiplikasjon av en eller flere bakterieceller. Kolonier av bakterier forskjellige typer skiller seg fra hverandre i morfologi, farge og andre egenskaper.

En ren bakteriekultur oppnås for diagnostiske studier, som består av identifikasjon, dvs. bestemmelse av slekten og arten til de isolerte bakteriene. Dette oppnås ved å studere deres morfologiske, kulturelle, biokjemiske og andre egenskaper (se skjema 1).

Morfologiske og tinktorielle tegn på bakterier studeres ved mikroskopisk undersøkelse av utstryk farget med forskjellige metoder og innfødte preparater.

Kulturelle egenskaper karakteriserer ernæringsbehov, forhold og veksttype av bakterier på faste og flytende næringsmedier. Disse egenskapene er etablert av morfologien til koloniene og vekstkarakteristikkene til kulturen.

De biokjemiske egenskapene til bakterier bestemmes av et sett med konstitutive og induserbare enzymer som er iboende i en bestemt slekt, art eller variant. I bakteriologisk praksis er sakkarolytiske og proteolytiske egenskaper til bakterier, som bestemmes på differensialdiagnostiske medier, oftest av taksonomisk betydning.

For å identifisere bakterier til slekt og art, er pigmenter viktige, og farger kolonier og kulturer i en rekke farger. For eksempel produseres det røde pigmentet av Serratia marcescens (herlig blodpinne), det gyldne pigmentet av Staphylococcus aureus (staphylococcus aureus), og det blågrønne pigmentet av Pseudomonas aeruginosa (blågrønn pusspinne).

For å etablere biovaren (chemovar, serovar, fagtype), utføres ytterligere studier for å utføre den tilsvarende markøren - bestemmelse av enzym, antigen, følsomhet for fager.

31. Mikroflora av jord, vann, luft. Patogene arter som vedvarer i det ytre miljø og overføres gjennom jord, vann, mat og luft.

Jorden. Avhengig av dybden på jordlaget endres også sammensetningen av mikrofloraen. I de øvre lagene, rike på plante- og dyrerester og godt forsynt med luft, dominerer aerobe mikroorganismer som er i stand til å bryte ned komplekse organiske forbindelser. Dypere jordlag inneholder mindre organiske forbindelser og luft, noe som resulterer i en overvekt av anaerobe bakterier.

Jorda fungerer som et habitat for sporedannende stenger av slektene Bacillus og Clostridium. Ikke-patogene basiller (Bac. megatherium, Bac. subtilis, etc.), sammen med pseudomonader, Proteus og noen andre bakterier, ammonifiserer, og danner en gruppe forråtningsbakterier som mineraliserer proteiner. Patogene basiller (årsaken til miltbrann, botulisme, stivkrampe, gass koldbrann) kan vedvare i jorda i lang tid.

Det er også mange representanter for sopp i jorda. Sopp deltar i jorddannende prosesser, transformasjoner av nitrogenforbindelser og skiller ut biologisk aktive stoffer, inkludert antibiotika og giftstoffer. Toksin-dannende sopp, når de kommer inn i menneskelig mat, forårsaker forgiftning - mykotoksikose og aflatoksikose.

Mikroflora av vann reflekterer den mikrobielle sammensetningen av jorda, siden mikroorganismer hovedsakelig kommer inn i vannet med partikler. Visse biocenoser dannes i vann med en overvekt av mikroorganismer som har tilpasset seg forholdene for lokalisering, belysning, løselighetsgrad av oksygen og karbondioksid, innhold av organiske og mineralske stoffer.

Ulike bakterier finnes i vannet i ferske reservoarer: stavformede (pseudomonas, aeromonas), kokkoider (mikrokokker) og kronglete. Vannforurensning med organiske stoffer er ledsaget av en økning i anaerobe og aerobe bakterier, samt sopp. Mikrofloraen av vann spiller rollen som en aktiv faktor i prosessen med selvrensing fra organisk avfall, som brukes av mikroorganismer. Representanter for den normale mikrofloraen hos mennesker og dyr (Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Clostridia) og patogener av tarminfeksjoner (tyfusfeber, paratyfusfeber, dysenteri, kolera, leptospirose, enterovirale infeksjoner) kommer inn med avløpsvann. Dermed er vann en faktor i overføringen av patogener av mange smittsomme sykdommer. Noen patogener kan til og med formere seg i vann (Vibrio kolera, Legionella).

Luftmikroflora sammenkoblet med mikrofloraen av jord og vann. Mikroorganismer kommer også inn i luften fra luftveiene og med spyttdråper fra mennesker og dyr. Solstråler og andre faktorer bidrar til at luftmikrofloraen dør. Koccoide og stavformede bakterier, basiller og clostridier, actinomycetes, sopp og virus finnes i luften. Mange mikroorganismer er inneholdt i luften i lukkede rom, hvis mikrobielle forurensning avhenger av graden av rengjøring av rommet, belysningsnivået, antall personer i rommet, hyppigheten av ventilasjon, etc. Antall mikroorganismer i 1 m3 luft (det såkalte mikrobielle tallet, eller luftforurensning) gjenspeiler den sanitære og hygieniske lufttilstanden, spesielt på sykehus og barneinstitusjoner. Indirekte kan frigjøring av patogene mikroorganismer (årsaksstoffer som tuberkulose, difteri, kikhoste, skarlagensfeber, meslinger, influensa, etc.) ved samtale, hoste, nysing av pasienter og bærere bedømmes ut fra tilstedeværelsen av sanitære indikatorbakterier (Staphylococcus) aureus og streptokokker), siden sistnevnte er representanter for mikrofloraen i de øvre luftveiene og har en felles utskillelsesvei med patogene mikroorganismer som overføres av luftbårne dråper.

32. Sanitære indikatormikroorganismer. If - titer, if - indeks, metoder for bestemmelse.

Sanitære indikatorer er mikroorganismer som kan brukes til indirekte og med en enda større grad av sannsynlighet å bedømme mulig tilstedeværelse av patogener i det ytre miljø.

Deres tilstedeværelse indikerer at gjenstanden er forurenset med sekreter fra mennesker og dyr, siden de konstant lever i de samme organene som patogener og har en felles utslippsvei til miljøet. For eksempel har patogener av tarminfeksjoner en felles utskillelsesvei (med avføring) med slike sanitærindikative bakterier som bakterier fra Escherichia coli-gruppen - (gruppen inkluderer bakterier av slektene Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella med lignende egenskaper), enterokokker , og clostridia perfringens. Årsakene til luftbårne infeksjoner har en felles utskillelsesvei med bakterier (kokker) som konstant lever på slimhinnen i de øvre luftveiene og slippes ut i miljøet (når man hoster, nyser, snakker), derfor har hemolytiske bakterier blitt foreslått som sanitære indikatorbakterier for innendørs luftstreptokokker og Staphylococcus aureus. Sanitære indikative mikroorganismer må oppfylle følgende grunnleggende krav:

1. må bare leve i kroppen til mennesker eller dyr og er konstant funnet i deres sekret;

2. må ikke formere seg eller leve i jord og vann;

3. deres overlevelsestid og motstand mot ulike faktorer etter utslipp fra kroppen til miljøet må være lik eller overstige sykdomsfremkallende mikrober;

5. Metoder for påvisning og identifikasjon må være enkle, metodisk og økonomisk tilgjengelige;

6. må finnes i miljøet i betydelig større mengder enn patogene mikroorganismer;

7. Det skal ikke være tilnærmet like innbyggere – mikroorganismer – i miljøet.

Coli indeks- antall Escherichia coli funnet i 1 liter (for faste stoffer på 1 kg) av objektet som studeres; bestemmes ved å telle kolonier av Escherichia coli dyrket på et fast næringsmedium ved såing av en viss mengde av testmaterialet, etterfulgt av omregning per 1 liter (kg). Coli-indeksen er en verdi proporsjonal med det faktiske innholdet av Escherichia coli i substratet som studeres.

Coli titer- dette er den minste mengden testmateriale i milliliter (for faste stoffer - i gram), der en E. coli ble funnet. For å bestemme kolititeren, inokuleres ti ganger avtagende volumer av testmaterialet separat på flytende medier (for eksempel 100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001 ml).

For å konvertere coli-titeren til coli-indeksen, del 1000 med tallet som uttrykker coli-titeren; For å konvertere coli-indeksen til coli-titer, del 1000 med tallet som uttrykker coli-indeksen.

33. Mikroflora av menneskekroppen i forskjellige aldersperioder. Rollen til mikrober - faste innbyggere i menneskekroppen i fysiologiske prosesser. Konseptet med dysbiose, dets klassifisering, manifestasjoner og behandlingsmetoder.

Mikroflora er kun lokalisert på huden og på slimhinnene i hulrom som kommuniserer med det ytre miljøet (bortsett fra livmoren og blæren). Alt kroppsvev er normalt helt fri for bakterier.

Den naturlige automikrofloraen i kroppen er et enkelt naturlig kompleks som består av et sett av heterogene mikrobielle samfunn i forskjellige deler av menneskekroppen.

Før fødselen er menneskekroppen steril; i livmoren er embryoet beskyttet mot mikrobiell invasjon av placenta og andre barrierer.

Mikrofloraen i fordøyelseskanalen er den mest tallrike og mest betydningsfulle for å opprettholde menneskers helse. Dens rolle er spesielt stor i det utviklende barnets kropp.

Det er to kritiske øyeblikk i prosessen med dannelse av intestinal mikrobiocenose. Den første er ved fødselen av et barn, når koloniseringen av den sterile tarmen begynner i løpet av den første dagen, den andre er når barnet er avvent fra amming.

Under fødselen kommer babyens hud og slimhinner for første gang i kontakt med mikrofloraen i morens fødselskanal, luften og hendene til medisinsk personell. Som et resultat er tarmmikrofloraen i de første dagene av et barns liv representert av en sammenslutning av aerober (hovedsakelig fakultative anaerober) - mikrokokker, enterokokker, clostridier, stafylokokker. Ved den 4-5. dagen av livet blir artssammensetningen av fekal mikroflora mer mangfoldig, assosiasjoner av ikke-sporedannende anaerober (bifidobakterier, propionibakterier, peptokokker, peptostreptokokker, bakteroider og fusobakterier) vises. Imidlertid dominerer fortsatt aerobe bakterier - laktobaciller, kokker og gjærsopp.

Videre dannelse av automikroflora i mage-tarmkanalen avhenger hovedsakelig av typen fôring. Ved amming av sunne fullbårne babyer, allerede på slutten av den første - begynnelsen av den andre leveuken, dominerer den anaerobe komponenten klart (mer enn 95%) i det mikrobielle samfunnet i tykktarmen på grunn av akselererte veksthastigheter. Den resterende delen (ca. 4-5%) er representert av en rekke fakultative aerober: laktobaciller, Escherichia, enterokokker, epidermale stafylokokker, gjærsopp.

Rollen til mikrober - faste innbyggere i menneskekroppen i fysiologiske prosesser

Mikrobielle biocenoser støtter normale fysiologiske funksjoner og spiller en viss rolle i immunitet. Forstyrrelser i mikrobielle biocenoser kan i mange tilfeller føre til forekomst av patologiske prosesser i de tilsvarende organene.

Mikrofloraen i tykktarmen spiller en viktig rolle. Den har uttalte antagonistiske egenskaper (spesielt anaerobe mikrober) og hindrer utviklingen av patogene bakterier som kan komme inn i tarmene med mat og vann, samt forråtnende bakterier. Mikrober - faste innbyggere i tarmene - produserer bakteriociner, antibiotika, melkesyre, alkoholer, hydrogenperoksid, fettsyrer, som undertrykker reproduksjonen av patogene arter. Tarmaraerober er altså med på å sikre koloniseringsmotstand, da de forhindrer kolonisering (kolonisering) av slimhinnene av fremmede mikroorganismer.

Tarmmikrober deltar også i prosessene med fordøyelse, vann-salt, protein, karbohydrater, lipidmetabolisme, danner en beskyttende film på tarmslimhinnen, bidrar til dannelse og utvikling av immunsystemet, deltar i nøytralisering av giftige forbindelser, syntetiserer biologisk aktive stoffer (vitaminer, antibiotika, bakteriociner).

Av stor betydning er E. coli, som har høy enzymatisk aktivitet, syntetiserer vitamin B1, B2, B12, B5, K, og har antagonistiske egenskaper mot patogene representanter for familien Enterobacteriaceae, mot stafylokokker og sopp. Candida.

Konseptet med dysbiose, dets klassifisering, manifestasjoner og behandlingsmetoder.

Dysbakteriose(dysbiose) er en tilstand som utvikler seg som følge av tap av normale mikroflorafunksjoner. I dette tilfellet er det et brudd på den eksisterende balansen mellom typene mikrober, så vel som mellom dem og menneskekroppen, dvs. eubiosetilstanden er forstyrret. Med dysbakteriose oppstår kvalitative og kvantitative endringer i den bakterielle mikrofloraen. Med dysbiose er det endringer blant andre mikroorganismer (virus, sopp). Dysbakteriose er forårsaket av ulike endogene (interne) og eksogene (eksterne) faktorer. Oftest utvikler intestinal dysbiose.

Type dysbakteriose etter patogen:

• 
  stafylokokker
• 
  Proteaceae
• 
  gjær
• 
  assosiert (stafylokokker, proteaceous, gjær)

• 
  kompensert - det kan ikke være noen kliniske manifestasjoner;
• 
  subkompensert - manifestasjoner av dysbiose forekommer noen ganger med kostholdsforstyrrelser, for eksempel;
• 
  dekompensert - adaptive mekanismer er oppbrukt, det er vanskelig å kurere dysbiose.