Tecnologie di base per la produzione di microchip di DNA. Microchip biologici Chip di DNA

Recentemente, si sono sviluppate attivamente le tecnologie del DNA, che consentono non solo di determinare un tratto, ma anche di eseguire contemporaneamente il sequenziamento differenziale, ad es. determinazione di mutazioni puntiformi o polimorfismi in regioni note del genoma. Queste tecnologie presentano vantaggi significativi rispetto ai tradizionali metodi biologici molecolari, perché consentono di miniaturizzare il campione di prova e l'analizzatore, riducendo significativamente il costo dell'analisi e il suo tempo, nonché di determinare contemporaneamente vari parametri del campione di prova, senza perdere la sensibilità dei metodi di amplificazione. Il vantaggio principale dei metodi basati sull'uso di chip con oligonucleotidi di tutte le possibili sequenze nucleotidiche di una determinata lunghezza è la loro versatilità. La presenza di un oligonucleotide di qualsiasi sequenza sul chip rende possibile analizzare qualsiasi sequenza in studio. L'uso dei microchip si basa sul principio di determinare rapidamente le interazioni di determinati ligandi con molte sonde diverse contemporaneamente. In realtà, i microchip biologici sono un supporto solido su cui vengono applicati determinati frammenti di acidi nucleici, proteine, carboidrati o qualsiasi altra molecola sonda che può essere riconosciuta o mostrare attività biologica. Il numero di sonde diverse su un substrato può raggiungere centinaia di migliaia e i chip di ciascun tipo sono rigorosamente identici e tecnologie esistenti può essere replicato in centinaia di migliaia e milioni di copie depositate su un substrato.

Microarray di DNA

Ci sono proteine, DNA, carboidrati e frammenti di tessuto. Attenzione speciale meritano chip di DNA. Rappresentano uno strumento analitico unico che consente di determinare la presenza di sequenze di DNA specifiche in un campione analizzato (solitamente di origine biologica) (la cosiddetta analisi di ibridazione). Effettuare l'analisi utilizzando i chip di DNA è molte volte più economico rispetto all'utilizzo di tecnologie alternative (elettroforesi, PCR in tempo reale) e, con un semplice rilevatore, consente di lavorare al di fuori del laboratorio.

I chip di DNA furono utilizzati per la prima volta nella ricerca alla fine degli anni '80 del secolo scorso. Questo metodo ormai molto diffuso, che consente l'analisi simultanea dell'espressione di molti geni, si basa sul principio del riconoscimento dei bersagli di mRNA o cDNA attraverso la loro ibridazione con frammenti di DNA a singolo filamento immobilizzati su un microchip.

Un chip di DNA è un supporto solido su cui sono immobilizzati frammenti di DNA a filamento singolo di diverse lunghezze (solitamente in modo covalente): corti - 15-25 nucleotidi, lunghi - 25-60 nucleotidi e frammenti di cDNA - da 100 a 3000 nucleotidi. Come materiali di supporto vengono utilizzati vetro, silicio, vari polimeri, idrogel (ad esempio a base di poliacrilammide) e persino oro.

L’ibridazione è la base della tecnologia

La base di tutto moderne tecnologie del DNA– ibridazione. Come risultato dell'ibridazione, le molecole di acido nucleico sono in grado di formare strutture stabili a doppio filamento grazie ai legami tra gli elementi delle molecole: nucleotidi. Il nucleotide adenina (A) è complementare alla timina (T), la guanina (G) è complementare alla citosina (C). Di conseguenza, la sequenza nucleotidica a filamento singolo ATGC formerà un'associazione stabile, una struttura a doppio filamento, con una molecola di DNA a filamento singolo della composizione TACG.

….. ATGC….

| | | |

…..TACG….

Tale complementarità porta all'“adesione” di due molecole di DNA, una delle quali può essere fissata in modo fisso sul substrato e formare un elemento del chip di DNA. Più molecole complementari agli elementi del chip sono contenute nel campione, più queste si legheranno al chip e maggiore sarà l'intensità del segnale percepito da questo elemento. Nella fig. La Figura 1 mostra il principio di funzionamento di una cellula di DNA o di un biochip oligonucleotidico, basato su interazioni complementari della base di adenina ( UN) con timina ( T) e guanina ( G) con citosina ( CON) in due filamenti di DNA. Se la sequenza di basi in un filamento di DNA (o oligonucleotide) è completamente complementare alla sequenza dell'altro filamento, allora si forma un'elica stabile e perfetta a doppio filamento: un duplex. Tuttavia, ad esempio, la presenza anche di una sola coppia errata nel duplex G-G, impedisce la formazione di duplex. Se si immobilizza un DNA specifico a filamento singolo o, ad esempio, un oligonucleotide (sonda) da 20 meri in uno degli elementi del microchip, quando i frammenti di DNA marcati con coloranti fluorescenti, ad esempio il genoma umano, vengono aggiunti al microchip, avverrà la loro interazione altamente specifica. Un dato elemento oligonucleotidico di un biochip legherà specificamente solo una sequenza complementare su 4 20 = 1,09x10 12 di tutte le possibili sequenze di questa lunghezza nel DNA. Di conseguenza, la luce fluorescente si osserva solo su questo elemento complementare del biochip. Pertanto, un elemento di un biochip produce un campione tra circa un trilione di possibili opzioni, a differenza di un elemento di un chip elettronico, dove avviene il campionamento binario: SÌ O NO.

Riso. 1. Schema della formazione di una doppia elica del DNA su un biochip. L'oligonucleotide è fissato su uno degli elementi del biochip e lega selettivamente solo quello complementare di molti frammenti di DNA marcati in modo fluorescente. Di conseguenza, solo questo elemento inizia a brillare. Ciò si verifica a causa di interazioni altamente specifiche di coppie di nucleotidi complementari UN Con T E G Con CON. La presenza di una coppia non complementare, ad es. G-G, impedisce l'interazione e lascia scuro l'elemento del microchip.

I dispositivi utilizzati per determinare i parametri di ibridazione consentono di registrare non solo il risultato finale, ma anche la cinetica di associazione e dissociazione delle catene complementari. Queste tecnologie, consentendo l’analisi multiparametrica dei campioni, possono fornire una grande quantità di informazioni. I risultati dell'ibridazione dipendono dalla lunghezza del campione di DNA, Composizione chimica DNA target etichettato, temperatura alla quale viene effettuata l'ibridazione, composizione della miscela di ibridazione, tipo di etichetta fluorescente. Va notato qui che i chip di DNA utilizzano principalmente l'ibridazione passiva, vale a dire l'interazione del DNA bersaglio con un campione immobilizzato è un processo probabilistico e dipende da varie condizioni.

Applicazioni dei chip di DNA

Valutare lo stato e identificare tutti i geni dell'organismo oggetto di studio è uno dei compiti più importanti per gli sviluppatori di chip di DNA. La soluzione a questo problema può essere realizzata nell'immobilizzazione di tutti i geni del corpo su un chip biologico, che consentirà una valutazione completa dello stato dei geni e del genoma nel suo insieme. Database biogenetici contenenti tutte le informazioni (sistematizzate) su geni e genomi vari organismi, offrono ai ricercatori enormi opportunità nella progettazione di chip di DNA.

Le ragioni principali per l'uso diffuso della ricerca sui biochip includono l'elevata sensibilità, specificità e riproducibilità, la semplicità della procedura di implementazione, la possibilità di analisi simultanea di molti parametri e il costo relativamente basso del lavoro. Queste stesse ragioni ci spingono a considerare i biochip come uno strumento promettente in diversi ambiti dell’economia nazionale.

Per riassumere, va notato che i microarray rappresentano un approccio efficace per l'identificazione simultanea di decine o migliaia di geni e dei loro analisi strutturale, per identificare sequenze nucleotidiche specifiche e variazioni nucleotidiche nella loro struttura. Tuttavia, quando i geni sono presenti nel genoma in una o più copie, cosa che si riscontra costantemente nella pratica clinica, è necessaria la loro amplificazione preliminare. Il metodo più efficace di amplificazione del DNA è la reazione a catena della polimerasi, durante la quale si verifica un aumento esponenziale del numero di molecole di DNA da diverse a milioni o più copie, e il vantaggio principale di questo tipo di PCR come Real Time consente anche un valutazione quantitativa della matrice in esame. Ciò è importante per risolvere i problemi nello sviluppo delle scienze fondamentali e integrali, nonché per ottimizzare le condizioni dei metodi diagnostici.

Pertanto, due metodi che sono già diventati tradizionali per alcune aree della scienza e della tecnologia applicata, insieme ai loro svantaggi, presentano vantaggi completamente unici.

PCR in tempo reale:

· consente di stimare l'ammontare della matrice originaria;

· non richiede ulteriori fasi di lavoro ad alta intensità di manodopera;

· l'assenza di una fase di elettroforesi ci permette di minimizzare il rischio di contaminazione e quindi di ridurre il numero di risultati falsi positivi;

· l'utilizzo di metodi matematici di analisi consente l'interpretazione automatica dei risultati ottenuti ed elimina il problema della valutazione soggettiva degli elettroferogrammi;

· prevede requisiti meno rigorosi per l'organizzazione del laboratorio PCR e la registrazione e interpretazione automatica dei risultati;

· consente di risparmiare tempo.

Microchip biologici:

· consentire la miniaturizzazione del campione e dell'analizzatore;

· consente di risparmiare tempo e costi di analisi;

· consente di determinare contemporaneamente diversi parametri del campione in esame;

· ha un'elevata sensibilità dei metodi di amplificazione, specificità e riproducibilità;

· Garantisce la semplicità della procedura di lavoro.

È possibile che la combinazione di questi metodi mediante la conversione della reazione a catena della polimerasi in un formato microchip consenta di creare un sistema diagnostico di nuova generazione, che sarà caratterizzato dalle seguenti qualità: maggiore sensibilità e, soprattutto, specificità per la determinazione di acidi nucleici, elevata produttività a basso costo di analisi, riduzione generale del numero di manipolazioni all'interno di ciascuna fase di analisi.

I microchip biologici (biochip), o, come vengono più spesso chiamati, microarray, sono uno degli strumenti più recenti nella biologia e nella medicina del 21° secolo.

introduzione

I biochip sono stati inventati alla fine degli anni '90 in Russia e negli Stati Uniti. La tecnologia dei microchip è un livello fondamentalmente nuovo ricerca di laboratorio, in quanto consente l'analisi simultanea di migliaia di campioni. Migliaia di molecole di DNA o proteine ​​vengono posizionate su vetrini per creare rispettivamente frammenti di DNA e proteine. Sulla base dei dati sperimentali, i dipendenti del Laboratorio di Ingegneria Cellulare sotto la guida del Dr. Sc. L'Istituto di biofisica teorica e sperimentale Beletsky I.P. (Pushchino, regione di Mosca) ha sviluppato una tecnologia per la produzione su larga scala di substrati di vetro nella produzione di chip di DNA, nonché il loro utilizzo nell'analisi di ibridazione del DNA. Si basa sull'uso del legame nucleotidico complementare. I biochip vengono utilizzati per diversi scopi. In medicina, i biochip aiutano a rilevare forme di tubercolosi e leucemia resistenti ai farmaci, nonché alcuni tipi di cancro, nei pazienti nel giro di poche ore. I biochip sono uno strumento indispensabile per i biologi che possono immediatamente, in un esperimento, vedere l'influenza di vari fattori (medicinali, proteine, alimentazione) sul funzionamento di decine di migliaia di geni.

Microchip biochimici

I microchip biochimici, le cui tecnologie di produzione e implementazione si stanno sviluppando attivamente in Russia e all'estero, sono gli strumenti più potenti esistenti per il rilevamento e l'identificazione di materiali biologici. L'uso dei microchip si basa sul principio di determinare rapidamente le interazioni di determinati ligandi con molte sonde diverse contemporaneamente. In realtà, i microchip biologici sono un supporto solido su cui vengono applicati determinati frammenti di acidi nucleici, proteine, carboidrati o qualsiasi altra molecola sonda che può essere riconosciuta o mostrare attività biologica. Il numero di sonde diverse su un substrato può raggiungere centinaia di migliaia e i chip di ciascun tipo sono rigorosamente identici e, con le tecnologie esistenti, possono essere replicati in centinaia di migliaia e milioni di copie depositate su un substrato.

Le ragioni principali per l'uso diffuso degli studi sui biochip comprendono l'elevata sensibilità, specificità e riproducibilità, la semplicità della procedura, la possibilità di analisi simultanea di molti parametri e il costo del lavoro relativamente basso. Queste stesse ragioni ci spingono a considerare i biochip come uno strumento promettente in diversi ambiti dell’economia nazionale. I biochip vengono utilizzati per rilevare la contaminazione batterica e virale negli alimenti, nei cosmetici e ambiente, rilevamento di organismi geneticamente modificati nei prodotti alimentari, diagnosi e previsione di varie malattie, rilevamento di agenti infettivi particolarmente pericolosi a fini antibioterrorismo, ecc.

Microarray di DNA

I chip di DNA sono uno strumento analitico unico che consente di determinare la presenza di sequenze di DNA specifiche in un campione analizzato (solitamente di origine biologica) (la cosiddetta analisi di ibridazione). Effettuare l'analisi utilizzando i chip di DNA è molte volte più economico rispetto all'utilizzo di tecnologie alternative (elettroforesi, PCR in tempo reale) e, con un semplice rilevatore, consente di lavorare al di fuori del laboratorio.

I chip di DNA furono utilizzati per la prima volta nella ricerca alla fine degli anni '80 del secolo scorso. Questo metodo ormai molto diffuso, che consente l'analisi simultanea dell'espressione di molti geni, si basa sul principio del riconoscimento dei bersagli di mRNA o cDNA attraverso la loro ibridazione con frammenti di DNA a singolo filamento immobilizzati su un microchip.

Un chip di DNA è un supporto solido su cui sono immobilizzati frammenti di DNA a filamento singolo di diverse lunghezze (solitamente in modo covalente): corti - 15-25 nucleotidi, lunghi - 25-60 nucleotidi e frammenti di cDNA - da 100 a 3000 nucleotidi. Come materiali di supporto vengono utilizzati vetro, silicio, vari polimeri, idrogel (ad esempio a base di poliacrilammide) e persino oro. I substrati più comuni sono in vetro.

Chips di proteine ​​e peptidi

Per analizzare i prodotti della traduzione genetica vengono utilizzati chip costruiti sulla base di polipeptidi. La maggior parte dei bersagli dei farmaci sono proteine, quindi i chip proteici e peptidici possono essere utili per la scoperta di farmaci. I microchip proteici possono essere estremamente utili in medicina come sistemi analitici in miniatura per determinare lo stato immunitario del corpo, rilevare la sensibilizzazione allergica e identificare allergeni specifici. I microchip, che rappresentano una raccolta dei principali antigeni dei principali organismi patogeni (batteri, funghi e virus), consentono di analizzare contemporaneamente campioni di sangue per verificare la presenza di centinaia e migliaia di anticorpi e di identificare rapidamente le infezioni. grande importanza nello sviluppo dei microchip proteici. Questi includono: il primo metodo conosciuto - RIA (radioimmunoassay), che utilizza un'etichetta radioattiva, l'immunodosaggio che utilizza etichette fluorescenti - FIA e il test immunoassorbente legato a un enzima (ELISA), in cui l'etichetta è una molecola enzimatica legata covalentemente a una molecola anticorpale . Enzimi stabili altamente attivi (fosfatasi alcalina, perossidasi, ecc.) vengono selezionati come etichette nell'ELISA. Il vantaggio dell'ELISA è la possibilità di amplificazione multipla del segnale. IN l'anno scorso Sono stati sviluppati sistemi di substrati sensibili che producono prodotti fluorescenti insolubili, ad esempio ELF-97. Ovviamente, il processo di fabbricazione di un microchip proteico deve comprendere la procedura di fissazione e immobilizzazione sul microchip. La scelta del metodo è determinata da molti parametri: la natura del substrato iniziale, il successivo campo di applicazione del microchip, ecc. I microchip proteici vengono utilizzati attivamente, innanzitutto, per l'analisi di tutti i fluidi biologici conosciuti (e disponibili), inclusi sangue, siero/plasma, urina, liquido cerebrospinale, saliva, liquido lacrimale, liquido amniotico, ecc.

Microchip di carboidrati

Molte biomolecole naturali (proteine, lipidi) vengono modificate con residui di zucchero. Spesso i processi biologici implicano il legame degli zuccheri ai recettori e i microarray possono essere uno strumento importante per studiare tali interazioni. I glicolipidi supportati su nitrocellulosa o fluoruro di polivinilidene sono un esempio di microchip di carboidrati. Questi glicolipidi interagiscono con proteine ​​di nota specificità legante i carboidrati per confermare le interazioni oligosaccaridi-proteine ​​previste. Il legame dei carboidrati alle membrane viene rilevato utilizzando glicolipidi marcati in modo fluorescente. La composizione dei carboidrati del componente legato viene determinata in situ mediante spettrometria di massa. È importante notare che gli oligosaccaridi associati ai lipidi possono essere di varia origine, come glicoproteine, proteoglicani, glicolipidi, cellule intere e oligosaccaridi sintetici. Pertanto, attraverso l'interazione degli oligosaccaridi la cui sequenza è nota con la membrana, è possibile identificare specifici motivi proteici associati allo zucchero. Al contrario, legando oligosaccaridi sconosciuti alla membrana, è possibile selezionare proteine ​​con strutture note per determinare a quali oligosaccaridi sono legate.

Microchip tissutali

I dati provenienti dall’analisi dell’espressione genica stanno appena iniziando a fornirci importanti informazioni sulla funzione biologica dei geni, sul loro potenziale impatto clinico o sulla loro idoneità come bersagli farmacologici. Allo stesso tempo, l'analisi istologica tradizionale dei campioni di tessuto richiede molto tempo: i tessuti vengono conservati in formaldeide, posti in paraffina, vengono realizzate le sezioni e solo successivamente vengono colorati e analizzati al microscopio su singoli vetrini. Nel 1998, sono stati prodotti per la prima volta microchip tissutali per tale analisi depositando numerosi campioni di tessuto su un unico substrato.

Per realizzare un microchip è necessario combinare fino a mille agobiopsie prelevate da campioni di tessuto inclusi in paraffina in un blocco di paraffina a coordinate specifiche. Da questo blocco vengono ricavate fino a 300 sezioni, che vengono trasferite sul vetro per la colorazione e l'analisi. Pertanto, da un blocco è possibile eseguire fino a 300mila analisi. Questo metodo provoca un danno tissutale minimo.

Una volta preparati, i microarray possono essere testati per l'interazione con una varietà di bersagli molecolari (DNA, RNA o proteine) in centinaia o addirittura migliaia di campioni di tessuto. La differenza fondamentale tra i chip di tessuto e, ad esempio, i chip di DNA è che nel secondo caso viene determinata l'espressione di migliaia di geni in un tessuto/campione, mentre nel primo viene determinata un gene in mille tessuti/campioni diversi. Il vantaggio dell'analisi dei microarray tissutali è che tutti i campioni di tessuto vengono elaborati allo stesso modo, vale a dire le concentrazioni dei reagenti, il tempo di incubazione, la temperatura e la composizione delle soluzioni rimangono invariate. Inoltre l'analisi richiede solo decimi o centesimi di millilitro di reagenti.

I microchip tissutali vengono utilizzati piuttosto attivamente per cercare marcatori associati a determinate malattie, principalmente il cancro. Vengono mostrati esempi di utilizzo riuscito di chip tissutali per l'analisi di malattie autoimmuni, insufficienza cardiaca, diabete e patologie neurodegenerative.

Procedura per l'analisi del DNA mediante biochip

Una sonda oligonucleotidica modificata con un gruppo fosfato all'estremità 5 è stata reticolata al vetro utilizzando un agente condensante (carbodiimmide in presenza di imidazolo). Quindi è stata effettuata l'ibridazione con un frammento oligonucleotidico marcato con biotina e una reazione di perossidasi colorata utilizzando un coniugato streptavidina-perossidasi. Il risultato dell'analisi è stato giudicato dall'intensità del colore del substrato ossidato, dimetilamminobenzidina (DAB).

Produzione di chip biologici

Sulla base dei dati sperimentali è stata sviluppata una tecnologia per la produzione su larga scala di substrati di vetro per la produzione di chip di DNA. Per l'uso diffuso delle tecnologie dei chip, semplici, economiche e metodi efficaci fabbricazione su larga scala e controllo di substrati modificati contenenti gruppi amminici superficiali.I substrati solidi più comunemente utilizzati per la fabbricazione di microchip sono vetri trattati con vari amminoalchiltrialcossisilani, come APTES (3-amminopropiltrietossisilano, Fig. 3) per ottenere una superficie modificata.

Fig. 3 Formula strutturale di APTES. a-in gratis condizioni, usato-modificato sul vetro

Questa superficie è idrofobica e consente l'applicazione di sonde con la massima densità. Come risulta dai dati della letteratura, le condizioni per ottenere un substrato di vetro ammino-modificato possono essere molto diverse. Ciò riguarda sia la concentrazione di APTES che la scelta del solvente, che a sua volta può contenere quantità variabili di acqua. Per produrre substrati modificati con ammine su larga scala, è auspicabile utilizzare solventi che siano il meno tossici ed economici possibile, come acetone ed etanolo. È stato dimostrato che la natura del solvente organico non ha praticamente alcun effetto sulla qualità dei vetri risultanti. L'attivazione degli acidi nucleici viene effettuata utilizzando carbodiimmidi (CDI) - questo è uno dei primi metodi ottenere assorbenti per affinità, cosa ancora abbastanza comune. Il metodo si basa sulla capacità delle carbodiimmidi di attivare il gruppo fosfato terminale degli acidi nucleici. Gli oligonucleotidi attivati ​​con carbodiimmide reagiscono facilmente con i gruppi amminici o solfidrilici dei trasportatori. Ad oggi, il meccanismo di attivazione dei gruppi fosfato degli oligonucleotidi da parte delle carbodiimmidi è stato studiato in modo sufficientemente dettagliato. Lo stadio limitante della reazione è la protonazione delle carbodiimmidi con la formazione di O-fosforilisouree reattive instabili intermedie. Gruppi nucleofili sufficientemente forti sul trasportatore possono inibire questo passaggio

Inoltre, i gruppi nucleofili protonati non sono in grado di reagire con i composti 1 [Fig. 4]. Di conseguenza, la resa del prodotto finale 2 quando si utilizzano polimeri con gruppi altamente basici può diminuire. Le O-fosforilisouree 3 sostituite possono anche essere trasformate in sottoprodotti, ad esempio idrolizzate per rilasciare il gruppo fosfato originale e urea, oppure subire una serie di trasformazioni sequenziali con la formazione di pirofosfati, polifosfati e derivati ​​della O-fosforilisourea. Quest'ultimo, a sua volta, può dare derivati ​​non reattivi della N-pirofosforilurea 3 o della N-fosforilurea 4.

Per aumentare l'efficienza di immobilizzazione dei nucleotidi sul polimero, l'attivazione con carbodiimmidi viene effettuata in presenza di un catalizzatore nucleofilo, l'imidazolo, che forma il corrispondente oligonucleotide fosfamide, il quale, dopo protonazione dei residui azolici, è un composto altamente reattivo rispetto ai nucleofili. Il più delle volte si ottengono i fosfoimidazolidi 5 (Fig. 5)

Il vantaggio di questo approccio è l’assenza di una serie reazioni avverse, poiché il derivato 5 è più stabile della O-fosforilurea 1. Il composto 5 interagisce più efficacemente con il gruppo amminico del trasportatore, il che aumenta la resa durante l'immobilizzazione.

Effettuare l'ibridazione.

L'analisi di ibridazione si basa sull'uso del legame nucleotidico complementare (Fig. 6b). Le reazioni attualmente conosciute possono essere divise in due grandi gruppi. Il primo gruppo di metodi si basa sull'amplificazione, ovvero la ripetizione ciclica della replicazione in vitro del frammento di DNA (RNA) desiderato. Il frammento amplificato viene quindi rilevato mediante elettroforesi su gel. Il secondo gruppo comprende metodi per il rilevamento diretto di una sequenza nucleotidica specifica (DNA o RNA) utilizzando brevi frammenti oligonucleotidici a filamento singolo aventi un gruppo reporter (sonda). Queste reazioni sono chiamate sondaggio del DNA. La loro sensibilità dipende dal tipo di sonda utilizzata e può essere molto elevata. Il gruppo reporter non radioattivo più comune incluso nelle sonde oligo e polinucleotidiche è la vitamina biotina (un cofattore naturale di un gruppo di enzimi - carbossilasi) (Fig. 6, A)

Riso. 6 Schema del metodo di analisi dell'ibridazione utilizzando l'esempio di identificazione di fonti di origine vegetale geneticamente modificate. A – PCR utilizzando primer marcati con biotina - indice (mb); B – ibridazione di prodotti di PCR con oligonucleotidi specifici immobilizzati su microchip biologico - indice (i)

Il derivato biotinilato del dUTP (bio-UTP) è incluso nelle catene formate dalle DNA polimerasi al posto della timina ed è capace di interazioni complementari con l'adenina.

La biotina è un composto resistente a alte temperature, ad ambienti acidi e alcalini, solubile in acqua e alcool. È un coenzima in molte reazioni di addizione (carbossilazione). La biotina può facilmente formare un composto stabile con varie proteine, inclusi enzimi e immunoglobuline. La biotina si trova in grandi quantità nell'albume degli uccelli, dove è associata alla glicoproteina avidina, che ha un peso molecolare di 68 kDa. La biotina ha un'affinità estremamente elevata per l'avidina e per il suo analogo batterico streptavidina (la costante di dissociazione del complesso biotina-avidina è 10-15 M) e forma un complesso estremamente stabile (KA = 10 alla 15a potenza per mole) la prima potenza negativa).

Reazione della perossidasi

Per effettuare la reazione della perossidasi viene utilizzato un coniugato costituito da un enzima associato alla streptavidina. Questo coniugato forma un complesso biotina-streptavidina molto forte, che viene utilizzato come ponte di collegamento tra il duplex di DNA formato durante l'ibridazione e il tag enzimatico.

L'enzima più utilizzato è la perossidasi di rafano, utilizzata per la prima volta da Nakane e Pierce. Una molecola enzimatica coniugata alla streptavidina è in grado di “elaborare” un gran numero di molecole di substrato. Sotto l'azione della perossidasi, il substrato H2O2 forma un complesso marrone, insolubile in acqua e alcool, con il colorante diaminobenzidina (DAB), che si accumula attorno al duplex fisso.

Elaborazione dei risultati dell'analisi

La visualizzazione del modello di ibridazione su un microchip biologico per il campione analizzato viene effettuata utilizzando il complesso hardware-software per l'analisi dei microchip biologici "EuroBioWto Biocontrol" e il programma per computer "MedGen". Il modello di ibridazione ottenuto sullo schermo del computer per il campione analizzato viene confrontato con il modello di ibridazione per il controllo positivo (noto DNA transgenico) e il modello di ibridazione per il controllo negativo (noto DNA non transgenico). Un esempio di diagramma del modello di ibridazione di un microchip biologico è mostrato in Fig. 9.

Riso. 9 Esempio di schema di microchip biologico per l'identificazione di fonti di origine vegetale geneticamente modificate: controllo positivo PC, controllo negativo NC, gene della proteina di soia Lect, gene della proteina di mais Zein, sequenze transgeniche Gus, Nos, 35s, Npt, Ocs

La presenza di colorazione brillante specifica del microchip biologico nelle aree contenenti oligonucleotidi di immobilizzazione (per i promotori 35S e Nos, terminatore Ocs, geni Gus o NptII) indica la presenza di specifiche sequenze di DNA estraneo nel campione analizzato, cioè la transgenicità del microchip biologico DNA analizzato. L'assenza di colorazione dopo l'analisi indica l'assenza di specifiche sequenze di DNA estraneo nel campione analizzato, cioè la non transgenicità del DNA analizzato. La presenza di colorazione NC indica un risultato falso positivo. La causa potrebbe essere la contaminazione dei reagenti e/o dell'attrezzatura GMI. In questo caso è necessario trattare le superfici dei banchi e delle attrezzature da laboratorio con una soluzione di acido cloridrico (1 mol/dm3 cubo), sostituire i reagenti con quelli appena preparati e ripetere l'analisi.

L'analisi mediante biochip è attualmente ampiamente utilizzata nella pratica. È caratterizzato da elevata sensibilità, semplicità della procedura, capacità di analizzare simultaneamente più parametri, specificità e riproducibilità. L'uso di microchip biologici può essere molto efficace in settori quali: rilevamento di contaminazione negli alimenti e nell'ambiente, diagnosi e previsione di malattie, rilevamento di elementi di armi biologiche, valutazione dell'efficacia dei farmaci. Lo sviluppo delle tecnologie dei biochip nella Federazione Russa è uno di quei settori ad alta tecnologia che riceve particolare attenzione.

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Analisi di ibridazione del DNA mediante microarray biologici

Un microchip di DNA è solitamente un piccolo wafer di silicio lucidato con speciali sonde di DNA attaccate alla sua superficie. Sono le sonde responsabili del riconoscimento del DNA. Una sonda è un piccolo pezzo di DNA sintetizzato artificialmente che ha lo scopo di identificare una singola mutazione. Su chip di diversi produttori sono presenti da diverse centinaia a diversi milioni di sonde e ciascuna rappresenta una mutazione unica.

Prima dell'analisi su un chip, il DNA viene isolato, ad esempio, dalla saliva, ripulito dalle sostanze estranee e tagliato in piccoli frammenti.

Quindi la soluzione con questi frammenti viene applicata al chip e lasciata per un po'. Questa fase è chiamata incubazione. Durante questo periodo, frammenti del DNA in esame penetrano tra le sonde del chip e quindi il processo può prendere due strade. In un caso, se la sequenza del frammento di DNA è un'immagine speculare (complementare) della sequenza di DNA della sonda, si verificherà un'aggregazione (ibridazione) perché le sezioni complementari del DNA si incastrano come i bordi di una cerniera. Se il frammento è solo parzialmente simile alla sonda o non lo è affatto, l'ibridazione non avverrà e continuerà a fluttuare liberamente tra le sonde.

Dopo l'incubazione, inizia una fase di lavaggio per rimuovere i frammenti non legati dal chip. In questo caso non vengono rimossi solo i frammenti liberi, ma anche quelli solo parzialmente ibridati. Se l'ibridazione avviene parzialmente, significa che il frammento non è entrato completamente nella sonda e deve essere rimosso. I frammenti di DNA completamente complementari aderiscono così bene alla sonda che non vengono lavati via in questa fase.

Dopo il lavaggio, sul chip rimangono le sonde associate alle regioni del DNA umano e le sonde libere.

Nella fase finale avviene l'identificazione di quelle sonde a cui sono legati i frammenti del DNA in esame. Qui gli approcci differiscono. Ad esempio, sul chip viene applicato uno speciale segno luminoso, che è saldamente collegato solo alle sonde “innestate”. I segni non legati vengono nuovamente lavati via e quindi il chip viene fotografato al microscopio. Il risultato è una griglia di tanti punti multicolori con luminosità diverse. Sapendo in che punto si trova quale sonda si può capire esattamente quali sequenze di DNA ha una persona, cioè quali mutazioni ha.

Il DNA in studio viene tagliato con particolari enzimi, gli enzimi di restrizione, che riconoscono particolari combinazioni nella sequenza nucleotidica e tagliano in base ad esse. Queste speciali combinazioni di nucleotidi sono sparse in modo abbastanza uniforme in tutto il DNA, quindi i frammenti hanno una lunghezza abbastanza uniforme.

L'applicazione uniforme sul chip si ottiene applicando i frammenti sotto forma di soluzione. E in esso il movimento termico (browniano) distribuisce uniformemente le molecole. Non resta che applicare una goccia della soluzione nel punto del chip in cui si trovano le sonde. E questo non è difficile: di solito una tale finestra su un chip ha dimensioni non superiori a 10x10 mm.

Risposta

Commento

) — una piastra in miniatura con frammenti di una sequenza nota applicati su di essa in un certo ordine per l'analisi genetica.

Descrizione

Un microchip di DNA è un dispositivo creato per analogia con i microcircuiti elettronici (chip), progettato per rilevare simultaneamente molte sequenze specifiche di DNA. Il microarray di DNA viene utilizzato per studiare l'espressione genica e cercare mutazioni nella ricerca biomedica. Il microchip è realizzato in vetro, silicone o plastica. Il DNA viene applicato su di esso utilizzando la microstampa meccanica e la cucitura chimica sotto forma di numerosi punti ordinati, ciascuno dei quali contiene un numero uguale di frammenti di DNA sintetizzati aventi una sequenza unica. In altre tecnologie per l'analisi dell'ibridazione dei geni, frammenti di DNA complementari vengono cuciti su perline microscopiche. I moderni microarray di DNA possono misurare simultaneamente l’espressione di decine di migliaia di geni negli esseri umani e identificare circa un milione di mutazioni. Il principio di funzionamento di un microchip per lo studio dell'espressione genica è il seguente. Il lavoro attivo di un gene in un dato tessuto si esprime nell'accumulo della sua matrice (mRNA). Tutti gli mRNA vengono estratti da un campione di tessuto e con l'aiuto dell'enzima trascrittasi inversa viene sintetizzato il cosiddetto DNA complementare (cDNA), che è molto più stabile e più facile da lavorare rispetto all'mRNA. L'insieme risultante di cDNA viene etichettato utilizzando etichette fluorescenti o radioisotopiche.

Il contenuto dei singoli cDNA in un campione è direttamente proporzionale al contenuto dei loro modelli di mRNA e, di conseguenza, al livello di attività dei geni corrispondenti. La miscela di cDNA viene applicata su un microchip, in ciascun punto del quale sono cuciti frammenti di DNA corrispondenti alla sequenza codificante di uno dei geni. I cDNA trovano i “loro” punti e si legano (ibridano) ad essi secondo il principio di complementarità. Quanto più cDNA di una data specie è presente nella soluzione, tanto più ne rimane attaccato alla sua punta. Uno speciale dispositivo di scansione determina quindi il contenuto di cDNA in ciascun punto del microchip e il programma lo correla con il nome del gene rappresentato da quel punto. Il risultato di uno studio di microarray di DNA è una matrice di punti, la cui intensità è direttamente proporzionale all'attività dei geni corrispondenti.

Illustrazioni

Autori

• Naroditsky Boris Savelievich
• Shirinsky Vladimir Pavlovich
• Nesterenko Lyudmila Nikolaevna

Fonti

1. Tecnologia del chip DNA / Ufficio per l'educazione e la divulgazione scientifica: Schede informative sulle tecniche di ricerca URL: http://www.genome.gov/DIR/VIP/Learning_Tools/Fact_Sheets/dna_chip.html (accesso il 12/10/2009)
2. Ke Y., Stuart L., Yung C., Yan L., Hao Y. Piastrelle sonda autoassemblate per acido nucleico idrosolubile per test di ibridazione dell'RNA senza etichetta.// Scienza – N. 5860 (319), 2008 – P.180-183

Un'importante innovazione nella biologia molecolare è stata la tecnologia dei microarray biologici. Questa tecnologia consente di utilizzare relativamente piccole quantità materiale di partenza, eseguire la reazione in microvolumi e contemporaneamente eseguire l'analisi multiparametrica di molti geni dello stesso oggetto.

La sua sensibilità è paragonabile ai metodi di amplificazione standard della diagnostica del DNA e in alcuni casi li supera.

A seconda della natura delle sonde immobilizzate, esistono 4 tipi principali di biochip:

chip di DNA;

Chip di RNA;

Microchip proteici;

Microchip cellulari.

Più ampiamente utilizzato nella ricerca e nella pratica clinica, in particolare per analizzare lo spettro di varie mutazioni o

varianti alleliche di diversi geni, ottenuti chip di DNA. Tipicamente si tratta di piastre di gel in miniatura con numerose rientranze e cellule contenenti una serie di sonde di DNA (Fig. 4.10), posizionate su vetro o membrana. Negli ultimi dieci anni, la tecnologia dei microarray è diventata un'area applicata delle scienze biologiche in rapido sviluppo: decine di aziende stanno sviluppando e offrendo microarray biologici contenenti array da diverse decine a centinaia di migliaia o più sonde di DNA. Utilizzando i biochip è inoltre possibile analizzare i cambiamenti del DNA come traslocazioni, duplicazioni, delezioni lunghe, nonché microduplicazioni e microdelezioni.

Le tecnologie per la produzione di chip di DNA differiscono per dimensione dei frammenti di DNA applicati, metodi di immobilizzazione, procedure di ibridazione e sistemi di rilevamento. Secondo la fase finale del rilevamento, i microchip sono di due tipi: ibridazione ed enzimatica. I chip di ibridazione, a seconda del metodo di lettura del segnale, si dividono in elettronici (Nanogen) e fluorescenti (Affymetrix, Illumina, Biochip), ecc. [Biochip: www.biochip. rn; Affymetrix: www.affymetrix.com; Biosistemi applicati: www.europe. applybiosystems.com; Asper Biotech: www.asperbio.com; Illumina: www. illumina.com; Nanogen: www.nanogen.com].

In questo caso, la discriminazione delle mutazioni può avvenire sia prima dell'ibridazione, cioè durante il processo di preparazione del campione (chip di Applied Biosystems, Affymetrix), sia durante il processo di ibridazione (Biochip). Ad esempio, illustriamo l'ibridazione

nuovi metodi di analisi delle mutazioni utilizzati da Biochip (1) e Affymetrix (2).

1. La tecnologia microarray proposta e sviluppata in Russia (Istituto di Biologia Molecolare intitolato a V. A. Engelhardt RAS) prevede un'amplificazione multiplex preliminare dei frammenti di DNA oggetto di studio utilizzando primer marcati con fluorescenza (o deossinucleotidi trifosfati). Aggiungendo un eccesso di uno dei primer ed eseguendo 2 cicli di replicazione, si ottiene la formazione di una grande quantità di prodotto a filamento singolo prevalentemente marcato. Quest'ultimo viene applicato al biochip, dove si ibrida con sonde oligonucleotidiche immobilizzate nel gel (Fig. 4.11). Se la sequenza del DNA da analizzare è completamente complementare alla sequenza della sonda di DNA, si forma un duplex stabile, facilmente rilevabile grazie al marcatore fluorescente. Tuttavia, se il frammento desiderato non è presente o è presente una base non complementare, non si forma un duplex stabile (non c'è segnale di fluorescenza). Questo metodo consente di analizzare fino a 50 varianti polimorfiche con una precisione superiore al 98%.

2. Per l'analisi del polimorfismo e delle mutazioni genetiche, utilizzando la tecnologia “Affymetrix”, si presuppone che

modificando i cosiddetti “campioni speciali”. Tali campioni sono costituiti da diversi frammenti: H1 e H2 - specifici per la sequenza di DNA da analizzare; P1 e P2 - che sono primer universali e fiancheggiano il sito per l'enzima clevasi; e una sequenza di tag - un'etichetta specifica per identificare uno specifico SNP durante l'ibridazione su un microarray (Fig. 4.12). Il rilevamento delle mutazioni avviene come segue: un “campione speciale” viene aggiunto al campione di prova contenente DNA a filamento singolo con la mutazione desiderata. Il campione si ibrida in modo complementare con la sequenza di DNA del campione analizzato (frammenti H1 e H2) (Fig. 4.12 A). Successivamente vengono aggiunti la DNA polimerasi termostabile e quattro diversi nucleosidi trifosfati (vengono utilizzate rispettivamente quattro provette). La DNA polimerasi completa l'estremità 3' della sonda H1 con una base corrispondente alla posizione variabile (Fig. 4.12 B). Successivamente viene eseguita una reazione di ligasi, in cui l'estremità 5' della base inserita è collegata all'estremità 3' della sonda H2 (Fig. 4.12 C). Nella fase successiva (Figura 4.12 D), l'esonucleasi distrugge il DNA rimanente del campione originale. Per un'ulteriore amplificazione, la molecola ad anello del campione viene tagliata con clevasi (Fig. 4.12 E). L'amplificazione viene effettuata utilizzando primer universali P1 e P2 (Fig. 4.12 F). Successivamente, i campioni vengono ibridati con un microchip. La specificità dell'ibridazione è ottenuta grazie a un frammento di tag appositamente progettato che, insieme ai primer universali, rappresenta una delle competenze di Asymetrix. Pertanto, nel campione in studio è possibile identificare in modo inequivocabile fino a 1000 o più SNP. La precisione del metodo quando si analizzano migliaia di SNP è di circa il 90%.

3. Un'altra opzione promettente per i biochip per l'analisi del polimorfismo genetico è progettata sulla base del metodo SBE (single base primer extension), che consente di ottenere un alto grado di discriminazione dei segnali di ibridazione sugli alleli di tipo “mutante” e “selvaggio”. Durante la preparazione dei campioni, il frammento di DNA in studio contenente il marcatore SNP viene prima amplificato, dopodiché viene ibridato su un biochip. La sequenza della sonda deve essere complementare alla sequenza del DNA da testare, inclusa la sua ultima base all'estremità 3', seguita dal nucleotide variabile. Il principio di rilevamento è il seguente: dopo l'ibridazione della sonda con il campione, alla reazione vengono aggiunti dideossinucleotidi marcati con coloranti diversi e DNA polimerasi. A causa della presenza di dideossinucleotidi, è possibile attaccare un solo singolo nucleotide all'estremità 3' della sonda immobilizzata. Dopo aver lavato il chip, la fluorescenza del campione di prova viene determinata da questo dideossinucleotide marcato. In termini di grado di discriminazione tra genotipi omozigoti ed eterozigoti, il metodo SBE è in media un ordine di grandezza superiore all'ibridazione con sonde allele-specifiche. Gli svantaggi di questo metodo sono la necessità di sintetizzare oligonucleotidi immobilizzati su un chip con un'estremità 3' libera, che preclude l'uso del metodo per il tipo più promettente di chip creati mediante fotolitografia.

4. Concettualmente simili alla tecnologia SBE sono i biochip creati sulla base del metodo APEX (estensione dei primer allineati - completamento dei primer sintetizzati su entrambi i filamenti di DNA). La differenza è che l'analisi testa non uno, ma entrambi i filamenti di DNA contemporaneamente e utilizza diverse sonde immobilizzate per ciascuna posizione. Ciò consente di identificare nuove mutazioni e siti polimorfici con un elevato grado di affidabilità. I chip basati sulla tecnologia APEX sono stati sviluppati dalla società estone Asper Biotech, mostrati nella Figura 4.13.

5. Sulla base dell'Istituto di ricerca AG omonimo sono state sviluppate diverse varianti di biochip di ibridazione. D. O. Otta SZO RAMS. Utilizzando uno di

Con essi – un “biochip farmacogenetico” – è possibile studiare la predisposizione ereditaria agli aborti ricorrenti e alla leucemia nei bambini. Il biochip consente l'analisi di 13 siti polimorfici allelici di 7 geni del sistema di disintossicazione: CYP1A1 (4887C>A, 4889A>G e 6235T>C), CYP2D6 (1934G>A e 2637delA), GSTM1 (delezione), GSTT1 (delezione). , NAT2 (481T >C,590A>G e 857A>G), CYP2C9 (430C>G e 1075C>T) e CYP2C19 (681G>A) e un gene dell'acido metilenetetraidrofolico (677C>T) - MTHFR. La Figura 4.14 mostra i risultati dell'analisi del biochip utilizzando un software speciale. Il “Farmagen-biochip” ha già superato gli studi clinici ed è stato introdotto nella pratica diagnostica di laboratorio in diversi centri medici della Federazione Russa. I biochip per testare la predisposizione ereditaria alla trombofilia (“TROMBO-biochip”) e alle malattie cardiovascolari (“Cardiobiochip”) sono in fase di sperimentazione clinica. Sono in corso i lavori per creare biochip per testare le principali mutazioni del gene CFTR nella fibrosi cistica, nonché la predisposizione ereditaria all'asma bronchiale e all'osteoporosi.

6. Meritano un'attenzione particolare i biochip che consentono lo screening di associazioni sull'intero genoma (Genome Wide Association Studies - GWAS).

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RE Digestione

grazie a ciò diventa possibile identificare tutti i geni marcatori, i loci genomici e i singoli SNP marcatori associati alle varie MD (vedi capitoli 2, 3, 9). A questo scopo, il campione di DNA in studio viene sottoposto ad idrolisi con alcune endonucleasi, i frammenti risultanti vengono ligati (collegati) con sequenze di DNA adattatore e amplificati con un primer specifico per il frammento di genoma in studio. I frammenti PCR risultanti vengono marcati con coloranti fluorescenti e ibridati con set di sonde di DNA posizionate sul biochip (Fig. 4.15). Sulla base dei risultati dell'analisi del modello di ibridazione del biochip utilizzando uno speciale programma per computer, si valuta se il campione studiato contiene un particolare insieme di varianti alleliche di sostituzioni a singolo nucleotide - SNP (Fig. 4.16). Il confronto delle frequenze degli alleli corrispondenti negli individui malati e sani ci consente di identificare tutti gli SNP e, di conseguenza, tutti i geni e i loci del DNA associati a una malattia specifica, cioè di determinare il profilo genetico specifico della MD. Il metodo consente di studiare fino a diverse decine e centinaia di migliaia di marcatori in un'unica analisi, ma la sua precisione non supera il 90%. Pertanto, nell'era moderna

Questo metodo non deve essere considerato più come un metodo di ricerca, ma non diagnostico. Attualmente, il metodo è utilizzato con successo per lo screening dell'intero genoma delle associazioni di varie malattie mediche, tra cui diabete di tipo 1 e di tipo 2, malattia coronarica, asma bronchiale, morbo di Crohn, psicosi maniaco-depressiva, ecc. (vedere sezioni 1, 6.1, 6.3 , 9).

7. Progressi significativi nell'aumento dell'efficienza, dell'accuratezza e del costo dei test di mutazione sono stati gli sviluppi degli ultimi due anni, volti a combinare gli indubbi vantaggi del metodo PCR in tempo reale con i principi della diagnostica con biochip (Fig. 4.17). Pertanto, utilizzando un biochip Fluidigm, è possibile analizzare simultaneamente mutazioni o testare SNP in 9216 loci. Il metodo ha una specificità e un'accuratezza maggiori rispetto al metodo di screening GWAS dell'intero genoma (vedere sezione 4.6.). Il costo per lo studio di una mutazione/polimorfismo non supera 1 rublo.

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