Coltivazione di microrganismi. Microbiologia generale

Per isolare una coltura pura di microrganismi, studiarne le proprietà biologiche a scopo di identificazione e anche per ottenere biomassa, è necessario propagare i microrganismi in laboratorio. La coltivazione, o crescita, dei microbi è possibile solo se vengono create determinate condizioni per la loro attività vitale. La maggior parte dei batteri, lieviti e muffe vengono coltivati ​​in terreni nutritivi artificiali. I virus e le rickettsie si riproducono solo nelle cellule viventi, nelle colture di tessuti, negli embrioni di pollo o nel corpo degli animali.

I terreni artificiali utilizzati per la coltivazione di microrganismi devono soddisfare determinati requisiti: essere facilmente digeribili, con la composizione richiesta di sostanze azotate e carboidratiche, vitamine, la concentrazione di sale richiesta, con un certo valore di pH (pH medio); avere proprietà tampone; avere un potenziale redox ottimale.

Anche i terreni nutritivi devono contenere una quantità sufficiente di acqua e prima della semina devono essere sterili, cioè privi di microrganismi. La fonte di azoto nei mezzi può essere costituita da vari composti organici e raramente inorganici. Il peptone, che è un prodotto dell'idrolisi proteica incompleta, viene spesso aggiunto a terreni privi di proteine. I microrganismi proteolitici possono utilizzare la gelatina ("gelatina animale") come sostanza azotata. La fonte di carbonio nei mezzi nutritivi è spesso costituita da carboidrati, alcoli e alcuni acidi organici.

Per preparare i terreni nutritivi artificiali è possibile utilizzare vari prodotti naturali: latte, sangue, siero di latte, carne, tuorlo d'uovo di gallina, patate e altre sostanze organiche e sali minerali.

I terreni nutritivi artificiali sono divisi in quattro gruppi principali in base allo scopo previsto: diagnostica universale, speciale, selettiva (elettiva) e differenziale.

I terreni universali includono il brodo di carne e peptone e l'agar di carne e peptone, su cui crescono molti tipi di batteri patogeni e non patogeni. I terreni speciali vengono utilizzati per coltivare batteri che non si riproducono sui terreni universali. I mezzi speciali includono latte, siero di sangue, con l'aggiunta di sangue animale, glucosio, ecc. Su di essi vengono coltivati ​​batteri dell'acido lattico, microrganismi patogeni e altri.

Negli ambienti selettivi (elettivi), solo i batteri di alcune specie si sviluppano bene. Tali ambienti includono ambienti di arricchimento in cui le specie di interesse per il ricercatore crescono più velocemente dei batteri associati. Il terreno Kessler, ad esempio, contenente viola di genziana e bile bovina, è selettivo per gli Escherichia coli gram-negativi resistenti a queste sostanze e allo stesso tempo selettivo per i batteri gram-positivi sensibili.

I terreni diagnostici differenziali vengono utilizzati per differenziare alcuni tipi di batteri in base alle loro proprietà culturali e biochimiche. Questi includono:

terreni per determinare l'attività proteolitica (gelatina peptonica di carne - MPG, agar latte, ecc.);

mezzi per determinare la fermentazione dei carboidrati (media Hiss, Endo, Ploskirev, ecc.);

terreni per determinare la capacità emolitica (agar sangue e altri terreni con aggiunta di sangue animale);

mezzi per determinare la capacità riducente (riducente) dei microrganismi (terreno Wilson-Blair);

Terreni selettivi utilizzati per differenziare batteri prototrofi e auxotrofi.

La consistenza dei mezzi nutritivi può essere solida, semiliquida o liquida. Per ottenere terreni con una consistenza densa, aggiungere il 2-2,5% di agar o il 10-20% di gelatina ai terreni liquidi. I terreni semiliquidi si ottengono aggiungendo lo 0,5-1,0% di agar. Agar (in malese "gelatina") - denso e fibroso sostanza ottenuta dalle alghe rosse e forma un gel denso (gelatina) in soluzioni acquose. È costituito principalmente da polisaccaridi (70-75%). I componenti principali dell'agar sono sostanze ad alto peso molecolare agarosio e agaropeptina, che non vengono scomposte e non assorbito dai microrganismi, pertanto l'agar non è un substrato nutritivo, viene aggiunto ai terreni esclusivamente per ottenere una consistenza densa.L'agar si scioglie in acqua a 100 ° C e solidifica a 40-43 ° C. Viene prodotto sotto forma di sostanza giallastra piastre o polvere bianco-grigiastra.

Le condizioni osmotiche necessarie per la vita dei microbi vengono create nel mezzo nutritivo aggiungendo cloruro di sodio o una certa combinazione di sali di fosfato di sodio e fosfato di potassio.

Per la vita dei microrganismi, la reazione dell'ambiente è di grande importanza: il valore del pH, che è determinato dal rapporto tra ioni idrogeno (H +) e idrossile (OH -). È il logaritmo del numero di concentrazioni assolute di ioni idrogeno.

L'indice di idrogeno di una reazione neutra corrisponde a 7,0. In questo caso, il numero di ioni idrogeno è uguale al numero di ioni ossidrile. Una lettura inferiore a 7,0 indica una reazione acida, mentre una lettura superiore a 7,0 indica una reazione alcalina. I microrganismi si sono adattati per svilupparsi in condizioni con un intervallo di pH estremamente ampio, da 2,0 a 8,5. La maggior parte dei microrganismi saprofiti e patogeni vengono coltivati ​​in un mezzo di reazione leggermente alcalino con un pH compreso tra 7,2 e 7,4. Per la coltivazione di batteri lattici, lieviti e muffe è necessario un ambiente di reazione acido, pH 5,0-6,5.

Attualmente, molti terreni nutritivi vengono prodotti sotto forma di semilavorati secchi già pronti contenenti tutti gli ingredienti necessari per la vita dei microrganismi. Per preparare il mezzo nutritivo, la polvere viene diluita con acqua, la miscela risultante viene fatta bollire, il valore pH richiesto viene regolato e sterilizzato.

Le condizioni di temperatura sono di grande importanza per la crescita e la riproduzione dei microrganismi sui mezzi nutritivi artificiali. In relazione al regime di temperatura, tutti i microrganismi sono divisi in tre gruppi: psicrofili (amanti del freddo), mesofili (medi), termofili (amanti del calore). I limiti di temperatura di riproduzione per gli psicrofili vanno da 0 a 20 °C, per i mesofili da 20 a 45 °C, per i termofili da 45 a 70 °C.

Quando si coltivano aerobi, le colture vengono coltivate in termostati con accesso all'ossigeno atmosferico, cioè in condizioni normali. Per la coltivazione degli anaerobi vengono create condizioni prive di ossigeno, che possono essere ottenute con metodi fisici, chimici e biologici. Vengono utilizzati anche termostati anaerobici.

I metodi fisici si basano sulla creazione del vuoto in speciali apparecchi anaerobici o in essiccatori sotto vuoto, nei quali vengono prima collocati i raccolti, quindi viene creato il vuoto nell'apparecchio.

A volte l'aria negli anaerostati viene sostituita con anidride carbonica, azoto o altro gas inerte. L'accesso dell'ossigeno al mezzo nutritivo può essere ostacolato se gli anaerobi vengono coltivati ​​in profondità in una colonna di agar nutriente o all'interno di tubi di vetro sigillati. Le condizioni anaerobiche possono essere create ancora di più in modi semplici: utilizzando uno strato di agar versato sulle colture su un mezzo nutritivo denso, oppure utilizzando olio di vaselina, che viene utilizzato per coprire un mezzo nutritivo liquido (terreno Kitta-Tarozzi).

Metodi chimici consistono nel porre in essiccatore i raccolti sostanze chimiche, ad esempio, pirogallolo e alcali, la reazione tra i quali avviene con l'assorbimento di ossigeno.

Il metodo biologico si basa sulla coltivazione simultanea di aerobi e anaerobi su terreni nutritivi solidi in piastre Petri ermeticamente chiuse. In questo caso, l'ossigeno viene assorbito dalla crescita degli aerobi seminati su una metà del terreno, dopodiché inizia la crescita degli anaerobi seminati sull'altra metà.

FORMAZIONE DI PIGMENTI E SOSTANZE AROMATICHE DA PARTE DEI MICRORGANISMI. BAGLIORE DI MICROBI

Pigmenti. Alcuni tipi di batteri e funghi che vivono nel suolo, nell'acqua e nell'aria sono in grado di produrre sostanze coloranti chiamate pigmenti.

I pigmenti si dividono in solubili in acqua, solubili in alcool, insolubili in acqua e insolubili in alcol. Esistono anche pigmenti cromofori che entrano nell'ambiente esterno e pigmenti cromofori situati nel citoplasma, nei vacuoli e nella membrana.

La formazione dei pigmenti avviene con un buon accesso all'ossigeno, nella maggior parte delle specie alla luce solare diffusa e ad una temperatura ottimale di 20-25 °C.

I microrganismi secernono vari pigmenti, il cui colore è determinato dal colore delle colonie su un mezzo nutritivo solido e talvolta dal colore di un mezzo nutritivo liquido. La piocianina, pigmento blu solubile in acqua, è prodotta da Pseudomonas aeruginosa. Il pigmento provoca difetti nel latte, rendendolo blu. Il pigmento verde idrosolubile fluoresceina è prodotto da bastoncini fluorescenti (Ps. fluorescens); Il pigmento rosso solubile in alcol prodigiosina è prodotto dal bastoncino miracoloso (Serratia marcescens). I pigmenti rossi possono essere prodotti anche da attinomiceti e lieviti, il pigmento rosa da lieviti e micrococchi rosa. Gli stafilococchi producono oro, bianco e fiori gialli. Le colonie di Sarcina sono di colore giallo, limone o dorato. Gli stampi producono prevalentemente pigmenti insolubili in acqua e alcool di colore nero, verde, marrone e marrone cioccolato. Il pigmento marrone è prodotto da alcuni ceppi di aerobi putrefattivi sporigeni (bastoncini di funghi, bastoncini di cavolo).

In assenza di condizioni favorevoli, i microrganismi che producono pigmenti non producono pigmenti e formano colonie incolori (colonie bianco-grigiastre).

La formazione del pigmento nei microbi ha un certo significato fisiologico. I pigmenti forniscono protezione cellulare dalle radiazioni ultraviolette naturali, partecipano alle reazioni biochimiche e hanno un effetto antibiotico.

Sostanze aromatiche. Alcuni microrganismi, durante i loro processi vitali, producono sostanze aromatiche volatili che conferiscono ai latticini (burro, formaggio) un odore e un sapore gradevoli e specifici. Di queste sostanze, le più importanti sono il diacetile, gli acidi volatili, l'alcol etilico, l'acetato di etile e gli eteri di acetato di amile, ecc.

Tra i batteri lattici, la formazione dell'aroma è più intensa negli streptococchi lattici eterofermentanti Lactococcus diacetylactis, Leuconostoe cremoris, Leuconostoc dextranicum.

L'intensità della formazione dell'aroma è influenzata dalla temperatura di fermentazione del latte, dalla reazione e dalle condizioni redox dell'ambiente. Le condizioni ottimali per la formazione dell'aroma per gli streptococchi lattici sono: temperatura 23-25 ​​° C; Il pH dell'ambiente è circa 5,0; potenziale redox Eh 6; agitazione periodica dell'antipasto per arricchirlo di ossigeno.

Durante la conservazione a lungo termine del prodotto, le sostanze aromatiche vengono distrutte, soprattutto a temperature elevate superiori allo zero.

Incandescenza microrganismi. Il bagliore (luminescenza) è una forma unica di rilascio di energia durante i processi ossidativi. I microrganismi luminosi possono far brillare diversi alimenti (carne, pesce, formaggio, ecc.). Penetrano nel corpo di piccoli crostacei, facendo sì che questi animali brillino intensamente di notte vicino alla riva del mare. In alcuni pesci, i batteri luminosi sono simbionti permanenti (conviventi) e fungono da fonte di luce. Alcuni funghi che vivono nei vecchi ceppi e nelle radici degli alberi brillano.

I batteri luminosi sono chiamati fotobatteri. Questi includono alcuni cocchi, vibrioni e bastoncelli che si colorano negativamente su Gram e non formano spore.

La maggior parte dei tipi di batteri luminosi sono aerobi, non causano decomposizione, crescono su substrati di pesce e carne e vengono coltivati ​​in ambienti normali. La temperatura ottimale di crescita e splendore è di 15-18 ° C, il contenuto di cloruro di sodio è di circa il 3%. Un tipico rappresentante dei microbi fotogenici è il Fotobacterium fosforeum, un bastoncino coccoide immobile che si sviluppa a 28 °C; la crescita si arresta a temperature superiori a 30 °C. Le proprietà proteolitiche non sono espresse, la gelatina non si liquefa.

Lo sviluppo di microbi fotogenici viene soppresso riducendo la concentrazione di sali nell'ambiente, sotto l'influenza di sulfamidici e altri prodotti chimici, vibrazioni sonore, sfregamento meccanico, estrazione con vari solventi, autolisi lenta, ecc.

Per temperatura ottimale crescita

Anatossine

Biglietto numero 26

1. Principi base della coltivazione batterica.Mezzi nutritivi.Principi di base della coltivazione di microrganismi su terreni nutritivi. 1. Utilizzo di tutti i componenti nutrizionali necessari per i microbi corrispondenti 2. Temperatura ottimale, pH, rH 2, concentrazione di ioni, grado di saturazione di ossigeno, composizione e pressione del gas. I microrganismi vengono coltivati ​​su terreni nutritivi alla temperatura ottimale in termostati che forniscono condizioni di incubazione. Per temperatura ottimale crescita Esistono tre gruppi principali di microrganismi: 1. Psicrofili - crescono a temperature inferiori a +20 gradi Celsius. 2. Mesofili - crescono nell'intervallo di temperature da 20 a 45 gradi (spesso ottimale a 37 gradi C). 3. Termofili - crescono a temperature superiori a più 45 gradi. Brevi caratteristiche dei mezzi nutritivi. In base alla consistenza si distinguono terreni liquidi, densi (1,5-3% agar) e semiliquidi (0,3-0,7% agar). L'agar è un polisaccaride di composizione complessa da alga marina, il principale indurente per mezzi densi (solidi). Come fonte universale di carbonio e azoto, vengono utilizzati i peptoni - prodotti della fermentazione proteica con pepsina, vari idrolizzati - carne, pesce, caseina, lievito, ecc. In base allo scopo del mezzo, sono suddivisi in numerosi gruppi:

Universale (semplice), adatto a vari microrganismi poco esigenti (brodo di carne e peptone - MPB, agar di carne e peptone - MPA); - speciale - terreni per microrganismi che non crescono su terreni universali (terreno McCoy per tularemia, terreno Levenshtein-Jensen per l'agente eziologico della tubercolosi); - diagnostica differenziale - per differenziare i microrganismi in base all'attività enzimatica e alle proprietà culturali (Endo, Ploskirev, Levin, Gissa media);

Selettivo (elettivo) - per isolare alcuni tipi di microrganismi e sopprimere la crescita di quelli associati - acqua peptone, mezzo selenite, mezzo di Muller... In base all'origine del mezzo, sono suddivisi in naturale, semisintetico e sintetico.

Biglietto numero 27

Anatossine

Preparati contenenti esotossine modificate chimicamente, prive di proprietà tossiche, ma che mantengono elevata antigenicità e immunogenicità. Questi farmaci forniscono la produzione di immunità antitossica (anticorpi antitossici - antitossine). I più utilizzati sono i tossoidi della difterite e del tetano. DTP - vaccino associato pertosse-difterite-tetano.

3 . virus del morbillo- un rappresentante del genere Morbillivirus della famiglia dei paramixovirus. Manca neuraminidasi. Ha attività emoagglutinante, emolitica e simplastica. Il virus possiede emoagglutinina, emolisina (F), nucleoproteina (NP) e proteina della matrice, che differiscono per specificità antigenica e immunogenicità. Diagnostica di laboratorio.1 Metodo diagnostico espresso: rilevamento di antigeni virali mediante anticorpi fluorescenti nelle cellule colpite. 2. Diagnosi virologica: il sangue viene esaminato prima della comparsa di un'eruzione cutanea, il muco del rinofaringe viene esaminato per l'infezione delle colture cellulari. Viene determinato l'effetto citopatico, il virus viene identificato in RTGA, RN e MFA.3. Metodi sierologici: RSK, RTGA, ELISA. Prevenzione specifica.Vengono utilizzati vaccini vivi attenuati. Nei contatti la sieroprofilassi può essere effettuata con immunoglobuline anti-morbillo o immunoglobuline di donatori normali.3.65 Poliovirus . Poliomielite: i poliovirus causano la poliomielite, un’infezione acuta che danneggia i neuroni. La proprietà biologica più importante dei poliovirus è il tropismo per le cellule motorie della sostanza grigia del midollo spinale.Il capside virionica è formato da quattro proteine ​​che formano la superficie esterna (VP1, VP2, VP3) e interna (VP4) del capside . Le proteine ​​dell'involucro sono importanti nel riconoscimento e nell'attaccamento ai recettori cellulari, nel rilascio dell'RNA virionica all'interno della cellula e nello sviluppo della paralisi. In base alle loro proprietà antigeniche, i poliovirus sono divisi in tre tipi; i poliovirus di tipo 1 hanno la maggiore virulenza ed epidemia attività. Diagnostica di laboratorio 1. La diagnosi virologica comprende l'isolamento del virus su varie colture cellulari o su topi bianchi neonati, seguito dall'identificazione per effetto citopatico, in RN, RTGA, RSC con sieri di riferimento.2. La diagnosi sierologica viene effettuata in varie reazioni (attualmente - ELISA), è necessario studiare i sieri accoppiati e identificare gli anticorpi IgM specifici. Immunità e prevenzione specifica.L'immunità ai poliovirus è duratura, causata da anticorpi neutralizzanti il ​​virus e cellule della memoria immunitaria. Per la prevenzione specifica vengono utilizzati vaccini uccisi e vivi attenuati.

Biglietto numero 28

1. Metodi di base per la coltivazione dei virus.

1. Nel corpo degli animali da laboratorio 2. Negli embrioni di pollo 3. Nelle colture cellulari: il metodo principale. Tipi di colture cellulari . 1. Colture primarie (tripsinizzate): fibroblasti di embrioni di pollo (CHF), fibroblasti umani (CHF), cellule renali di vari animali, ecc. Le colture primarie sono ottenute da cellule di vari tessuti il ​​più delle volte mediante frantumazione e trypsinizzazione e vengono utilizzate una volta, ad es. è sempre necessario disporre degli organi o dei tessuti appropriati 2. Le linee cellulari diploidi sono adatte alla dispersione e alla crescita ripetute, di norma non più di 20 passaggi (perdono le loro proprietà originali) 3. Linee trapiantabili (colture eteroploidi), capace di dispersione e trapianto ripetuti, cioè e. a passaggi multipli, più convenienti nel lavoro virologico - ad esempio, le linee cellulari tumorali Hela, Hep, ecc. 2. Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH)- ipersensibilità cellulo-mediata o ipersensibilità di tipo 4 associata alla presenza di linfociti sensibilizzati. Le cellule effettrici lo sono Cellule T DTH avere recettori CD4.La sensibilizzazione delle cellule T nella TOS può essere causata da agenti allergici da contatto (apteni), antigeni di batteri, virus, funghi e protozoi. Meccanismi simili nel corpo causano antigeni tumorali nell'immunità antitumorale, antigeni geneticamente estranei del donatore nell'immunità al trapianto. Le cellule T del DTH riconoscono antigeni estranei e secernono interferone gamma e varie linfochine, stimolando la citotossicità dei macrofagi, migliorando il T- e Risposta immunitaria B, che causa l'insorgenza di un processo infiammatorio Storicamente, la TOS è stata rilevata nei test allergologici cutanei (con tubercolina - test della tubercolina), rilevati 24 - 48 ore dopo l'iniezione intradermica dell'antigene. Solo gli organismi con una precedente sensibilizzazione a questo antigene rispondono allo sviluppo della TOS sull'antigene somministrato.Un classico esempio di TOS infettiva è la formazione di un granuloma infettivo (nella brucellosi, nella tubercolosi, nella febbre tifoide, ecc.). Dal punto di vista istologico, la terapia ormonale sostitutiva è caratterizzata dall'infiltrazione nella lesione prima da parte dei neutrofili, poi dei linfociti e dei macrofagi. Le cellule T sensibilizzate del DTH riconoscono epitopi omologhi presentati sulla membrana delle cellule dendritiche e secernono anche mediatori che attivano i macrofagi e attraggono altre cellule infiammatorie nel sito. I macrofagi attivati ​​e altre cellule coinvolte nel DTH rilasciano una serie di sostanze biologicamente attive, causando infiammazione e distruggendo batteri, tumori e altre cellule estranee: citochine (IL-1, IL-6, fattore di necrosi tumorale alfa), metaboliti attivi dell'ossigeno, proteasi, lisozima e lattoferrina. 3. Stafilococco . Il genere comprende più di 20 specie, di cui le più importanti sono S.aureus, S.epidermidis, S.saprophyticus Cocchi Gram-positivi, caratterizzati dalla disposizione reciproca in grappoli a forma di grappoli d'uva. Hanno una microcapsula, non formano spore e non hanno flagelli Anaerobi facoltativi, chemioorganotrofi. Crescono bene su terreni nutritivi semplici, su terreni densi formano colonie opache rotonde (2-4 mm di diametro) uniformi, colorate con il colore del pigmento lipocromo (crema, giallo, arancione). Oltre alle forme S, le colonie possono formare forme R. Nei mezzi liquidi producono una torbidità uniforme, poi si forma un precipitato sciolto, hanno un'elevata attività biochimica, formano vari enzimi: la catalasi è positiva, l'ossidasi è negativa. I carboidrati fermentano in acido senza gas, liquefano la gelatina per formare un imbuto e formano idrogeno solforato. In base alla presenza di coagulasi, sono divisi in due gruppi: coagulasi positivi e coagulasi negativi. Tra le specie patogene solo S.aureus è positivo alla coagulasi, le restanti sono negative.Gli antigeni specie-specifici sono gli acidi teicoici, proteina A dello Staphylococcus aureus. Le tossine hanno proprietà antigeniche. Fattori di patogenicità microcapsula, componenti della parete cellulare (acidi teicoici, proteina A), enzimi e tossine. I fattori di adesione sono le elevate proprietà idrofobiche delle strutture superficiali. I componenti della parete cellulare stimolano lo sviluppo di reazioni infiammatorie, dove i neutrofili svolgono un ruolo importante. Una varietà di enzimi stafilococcici svolgono il ruolo di fattori di aggressione e difesa. Il fattore principale è la plasmacoagulasi, che coagula il siero sanguigno (plasma) e forma una sostanza simile alla trombina che avvolge gli stafilococchi e impedisce l'azione delle reazioni di difesa del corpo. Esotossine: le tossine che danneggiano la membrana possono danneggiare i globuli rossi (emolisine), i leucociti, i macrofagi, le piastrine, ecc. Ne esistono diversi tipi che differiscono per struttura antigenica, spettro di cellule lisate e velocità d'azione. Le tossine esfoliative hanno un effetto dermatonecrotico ( pemfigo dei neonati) Esotossina che causa la sindrome da shock tossico. Gli assorbenti altamente assorbenti hanno causato un grave shock endotossico nelle donne.Enterotossine associate a intossicazione alimentare. Le enterotossine sono proteine ​​termostabili con proprietà superantigeniche. Causano un'eccessiva sintesi di interleuchina 2, che provoca intossicazione. L'intossicazione è spesso associata al consumo di latticini infetti da stafilococchi.5. Un certo numero di esotossine e altre strutture di stafilococchi hanno un effetto allergenico, causando l'effetto dello sviluppo della TOS. La presenza di antigeni con reazione crociata contribuisce allo sviluppo di processi autoimmuni.6. Fattori che inibiscono la fagocitosi: capsula, proteina A, acidi teicoici, peptidoglicano, tossine. Proprietà speciali dell'agente patogeno. 1. La capacità di influenzare quasi tutti i tessuti e gli organi.2. Resistenza molto elevata tra i batteri non sporigeni ai fattori ambientali.3. Presenza costante sulla pelle e sulle mucose comunicanti con l'ambiente esterno.4. Proprietà superantigeniche.5. Elevata variabilità e resistenza agli antibiotici, importanti per il processo epidemico. Immunità post-infettiva Le infezioni da stafilococco possono essere suddivise in cellulari e umorali, antibatteriche e antitossiche.Antitossine, anticorpi antibatterici, anticorpi contro enzimi patogeni, linfociti T, fagociti (macrofagi tissutali in forme localizzate) svolgono un ruolo importante nella protezione. Diagnostica di laboratorio. Vengono utilizzati metodi batteriologici, microscopici e sierologici. Il principale è il metodo batteriologico.Il materiale per la ricerca è sangue, pus, muco dal naso e dalla faringe, secrezione della ferita, espettorato (per polmonite), feci (per colite), prodotti sospetti, vomito e lavanda gastrica, feci - per intossicazione alimentare Viene eseguita una batterioscopia, identificando i cocchi gram-positivi sotto forma di grappoli d'uva (stafilococchi). Il materiale viene seminato su semplici terreni nutritivi. Le colonie sospette vengono selezionate e sottocoltivate per lo studio su terreni differenziali: agar sangue (emolisi), agar latte-sale e agar latte-tuorlo-sale (a causa di NaCl, la crescita della microflora estranea è inibita, l'uso dei terreni consente una migliore identificare pigmento e lecitinasi). La coltura isolata viene identificata in base alle caratteristiche della specie, vengono determinate la presenza di pigmento dorato, l'attività della plasmacoagulasi, la fermentazione del mannitolo, l'emolisi, la sensibilità agli antibiotici e viene eseguita la tipizzazione dei fagi. Tra i test sierologici, RPHA ed ELISA sono più spesso utilizzati per rilevare gli anticorpi agli antigeni specie-specifici (acidi teicoici).Per determinare l'enterotossigenicità, vengono spesso utilizzati un metodo biologico, determinazione dell'enterotossina nella reazione di precipitazione in agar, determinazione della RNasi (correlata con la produzione di enterotossina). Prevenzione e trattamento Per effettuare un'adeguata terapia antimicrobica è necessario determinare la sensibilità delle colture agli antibiotici (principalmente ai beta-lattamici); nei casi gravi e protratti viene utilizzata l'immunoglobulina antistafilococcica del donatore. Per creare l'immunità, viene utilizzato il tossoide stafilococcico, che crea un'immunità antitossica.

Biglietto numero 29

1. Antibiotici Uno dei meccanismi universali di antagonismo dei microrganismi è la sintesi di antibiotici, che inibiscono la crescita e la riproduzione dei microrganismi (effetto batteriostatico) o li uccidono (effetto battericida). Gli antibiotici sono sostanze che possono essere ottenute da microrganismi, piante, tessuti animali e sinteticamente, che hanno una pronunciata attività biologica contro i microrganismi. Esistono numerosi requisiti per gli antibiotici: efficacia a basse concentrazioni; - stabilità nel corpo e in varie condizioni di conservazione; - bassa tossicità o sua assenza; - pronunciato effetto batteriostatico e (o) battericida; - assenza di effetti collaterali pronunciati; - assenza di effetti immunosoppressori I primi antibiotici scoperti furono la penicillina (Fleming) e la streptomicina (Waxman).

Gli antibiotici possono essere suddivisi per origine, direzione e spettro d'azione, per meccanismo d'azione.Per origine gli antibiotici possono essere: - batterici (polimixina, gramicidina); - attinomiceti (streptomicina, cloramfenicolo, eritromicina); - fungini (penicillina); - vegetali (rafanina, fitoncidi); - animali (interferoni, lisozima). allo spettro gli antibiotici si dividono in: - che agiscono prevalentemente sulla microflora gram-positiva - penicillina, eritromicina; - che agiscono prevalentemente sulla microflora gram-negativa - polimixina; - ad ampio spettro (sulla flora gram-più e gram-meno) - streptomicina, neomicina; - antifungino - nistatina, amfotericina, levarina, nizoral; - antitubercolare - streptomicina, kanamicina; - antitumorale - rifampicina; - antivirale - interferone, zovirax, aciclovir Gli antibiotici sono suddivisi in base al loro meccanismo d'azione: - inibitori del pepticoglicano della parete cellulare sintesi (penicillina, cefalosporina, vancomicina, ristomicina). Agiscono sui batteri in crescita con una parete cellulare, non agiscono sulle forme L, forme di batteri riposanti; - inibitori della sintesi proteica (streptomicina, cloramfenicolo, tetraciclina); - inibitori della sintesi degli acidi nucleici, purine e aminoacidi (acido nalidixico , rifampicina); - inibitori della sintesi delle membrane e della membrana citoplasmatica dei funghi (nistatina, polimixina).

3. Pneumococchi. Una posizione speciale nel genere Streptococcus è occupata dalla specie S. pneumoniae (pneumococco)- agente eziologico della polmonite lobare, delle malattie infiammatorie polmonari acute e croniche. Si differenzia dagli altri streptococchi per morfologia (di solito i diplococchi hanno la forma di una fiamma di candela, con estremità piatte rivolte l'una verso l'altra, hanno una capsula pronunciata), specificità antigenica (hanno 83 sierotipi per l'antigene polisaccaridico capsulare), elevata sensibilità alla bile e optochina e causano l'alfa emolisi. Il principale fattore di patogenicità è la capsula polisaccaridica. Diagnostica di laboratorio. Il principale metodo diagnostico è batteriologico. Materiale per la ricerca: sangue, pus, muco dalla gola, placca dalle tonsille, secrezione dalla ferita. Il fattore decisivo nello studio delle colture isolate è la determinazione del sierogruppo (specie). Gli antigeni gruppo-specifici vengono determinati nella reazione di precipitazione, agglutinazione al lattice, coagglutinazione, ELISA e in MFA con anticorpi monoclonali (MAbs). I metodi sierologici sono più spesso utilizzati per diagnosticare reumatismi e glomerulonefrite di eziologia streptococcica: vengono determinati gli anticorpi contro la streptolisina O e la streptodornasi.

La coltivazione dei microrganismi può essere effettuata con metodi superficiali o profondi, discontinui o continui, in condizioni aerobiche o anaerobiche. Di grande importanza nella scelta del metodo di coltivazione è il rapporto tra il microrganismo scelto per la coltivazione e l'ossigeno molecolare e l'obiettivo finale della coltivazione: accumulo di biomassa o produzione di un determinato metabolita (alcol, ossigeno, enzima, ecc.).

Se coltivato con il metodo di superficie i microrganismi crescono sulla superficie di un mezzo denso e granulare o in uno strato sottile di un mezzo liquido, mentre i microrganismi ricevono ossigeno direttamente dall'aria. Nei mezzi liquidi spesso crescono microrganismi aerobici, formando una pellicola sulla superficie. Gli anaerobi facoltativi si sviluppano non solo sulla superficie, ma anche nello spessore del mezzo liquido, provocandone la torbidità più o meno uniforme. Le preparazioni enzimatiche vengono ottenute utilizzando mezzi sfusi utilizzando il metodo superficiale. La coltivazione superficiale di microrganismi viene utilizzata sia in condizioni di laboratorio che nell'industria.

Tutti i metodi di coltivazione dei microrganismi aerobici si riducono all'aumento della superficie di contatto del mezzo nutritivo con l'ossigeno atmosferico. Durante la coltivazione profonda Nei mezzi liquidi, i microrganismi utilizzano l'ossigeno disciolto. Allo stesso tempo, la solubilità dell'ossigeno nell'acqua è bassa, pertanto, per garantire la crescita di microrganismi aerobici nello spessore del mezzo, deve essere costantemente aerato (fornire ossigeno in profondità nel mezzo liquido). Viene chiamata la combinazione di un mezzo nutritivo e di microrganismi che crescono in esso fluido di coltura .

Il metodo di coltivazione profonda più utilizzato nella pratica di laboratorio è la coltivazione su sedie a dondolo, che prevedono l'agitazione o la rotazione di palloni o provette, garantendo un maggiore contatto del mezzo con l'aria e la saturazione con l'ossigeno. Aerare la coltura dei microrganismi può essere soffiata ( ribollente) attraverso uno strato di aria sterile. Questo metodo è utilizzato in ricerca di laboratorio, ma ha trovato applicazione particolarmente ampia nella microbiologia industriale nella produzione di biomassa, nella produzione di antibiotici, enzimi e acidi.

I vantaggi della coltivazione profonda sono che questo metodo non richiede grandi aree e attrezzature ingombranti, il volume dei fermentatori può essere aumentato aumentando l'altezza, la facilità di manutenzione, la possibilità di automazione e la comodità di isolare il prodotto target dalla coltura liquido.

La coltivazione profonda dei microrganismi può essere periodica o continua. A metodo periodico Durante la coltivazione, l'intero volume del mezzo nutritivo viene seminato con una coltura pura e la coltivazione viene effettuata in condizioni ottimali per un certo periodo di tempo fino all'accumulo della quantità richiesta del prodotto target. Poiché la coltivazione viene effettuata su un mezzo nutritivo non rinnovabile (in condizioni stazionarie), le cellule si trovano in condizioni costantemente mutevoli. All'inizio hanno un'abbondanza di tutte le sostanze nutritive, poi gradualmente arriva la mancanza di nutrizione e l'avvelenamento da prodotti metabolici dannosi. A questo proposito, la cultura nel suo sviluppo attraversa quattro fasi di crescita e riproduzione, durante le quali cambiano le dimensioni delle cellule, i tassi di riproduzione, le proprietà morfologiche e fisiologiche (Fig. 3.1).

Primo stadio– la fase di latenza, o fase di inibizione della crescita, segue immediatamente l'introduzione del materiale del seme nel mezzo nutritivo. In questa fase i microrganismi non si riproducono, ma si adattano all’ambiente; il contenuto di acidi nucleici aumenta e le loro dimensioni aumentano. Questa fase è la preparazione per un'ulteriore sintesi proteica intensiva da parte della cellula, cioè la sua crescita e riproduzione.

Seconda fase– la fase di crescita logaritmica (esponenziale) è caratterizzata da un alto tasso di riproduzione cellulare, poiché l’ambiente contiene molti nutrienti e poco prodotti nocivi scambio. Il tempo necessario affinché il numero di celle raddoppi è chiamato durata della generazione. In condizioni favorevoli, le cellule batteriche si dividono ogni 20-30 minuti, il loro numero aumenta progressione geometrica(1, 2, 4, 8, 16, ecc.).

Terza fase – stazionario (fase di maturità), quando la riproduzione dei microrganismi rallenta e i tassi di riproduzione e morte sono equilibrati, per cui il numero di cellule rimane costante.

Quarta fase– la fase della morte, quando inizia la morte delle cellule e il loro numero diminuisce a causa della morte e dell’autolisi (autodigestione).

La coltivazione batch viene effettuata in molte industrie in base all'attività vitale dei microrganismi. Lo svantaggio della coltivazione periodica è il tempo irrazionale impiegato per attraversare tutte e quattro le fasi dello sviluppo del raccolto, e il periodo dell'attività vitale più attiva - la fase di crescita logaritmica - occupa una piccola parte del ciclo di produzione.

Negli ultimi trent'anni è diventato sempre più importante un metodo più progressista di coltivazione continua di microrganismi, che consiste nel posizionare la coltura in un apparecchio speciale in cui affluisce costantemente mezzo nutritivo fresco e con la stessa velocità viene rimosso il liquido di coltura. Il seme viene portato allo stadio di crescita logaritmica e aggiunto al mezzo nutritivo. La durata del periodo di crescita logaritmica dipende dalla quantità di nutrienti nel mezzo, nonché dalla quantità di prodotti metabolici dannosi rilasciati dalla cellula.

Con un tasso di afflusso elevato, l'ambiente si rinnova rapidamente, i nutrienti non hanno il tempo di accumularsi e la coltura si mantiene in uno stato attivo per tutto il tempo desiderato, senza raggiungere lo stadio di morte. Nonostante la notevole complessità hardware processo tecnologico, il metodo di coltivazione continua presenta numerosi vantaggi rispetto al metodo batch.

IN l'anno scorso un metodo di coltivazione continua di cellule di microrganismi in immobilizzato stato (allegato) - su film, granuli, fibre di materiali polimerici sintetici appositamente selezionati. Le cellule microbiche immobilizzate funzionano ripetutamente e mantengono un'elevata attività biochimica per lungo tempo.

La coltivazione continua è molto promettente ed è ampiamente utilizzata nell'industria alimentare e microbiologica e crea la possibilità di mantenere automaticamente specificati condizioni ottimali, garantendo così la standardizzazione del prodotto finito al minor costo.

76. Perché è interessante il metodo di coltivazione della cimatura volumetrica?

Quando parte del volume del bioreattore viene rimossa di tanto in tanto quando viene aggiunto un volume equivalente di mezzo. Ciò porta ad un regolare ringiovanimento della cultura e ad un ritardo nella sua transizione alla fase morente.

77. Perché è interessante il metodo di coltivazione con alimentazione?

Oltre a introdurre un substrato nutritivo nel reattore prima di introdurre un oggetto biologico al suo interno, durante il processo di coltivazione i nutrienti vengono aggiunti all'apparato a determinati intervalli in porzioni o continuamente "goccia a goccia". A volte viene introdotto anche un oggetto biologico.

78. Perché è interessante il metodo di coltivazione della dialisi?

Il substrato nutritivo entra costantemente nel reattore attraverso una membrana speciale. La dialisi porta ad una diminuzione della concentrazione dei prodotti di scarto cellulare che influiscono negativamente sulla loro vitalità.

79. Come funziona un fermentatore dislocante?

Un sistema a spostamento aperto differisce da un sistema di miscelazione ideale in quanto la coltura al suo interno non è miscelata, ma è un flusso di fluido attraverso un tubo. L'apparato di coltivazione più comune in questo caso è un fermentatore tubolare. Questo principio può essere utilizzato durante la fase di fermentazione della produzione della birra.

80. Come funziona un fermentatore a cilindrata totale?

Questi includono turbostati e statistiche del pH. La cultura vi è mescolata.

81. Come sono regolati i chemostati e i turbidostati?

Chemostato: l'apporto del mezzo nutritivo è regolato dalla densità cellulare ed è controllato direttamente: viene impostata la portata e la concentrazione di biomassa viene adattata ad essa.

Turbidostato – regolato dalla densità cellulare, controllato secondo il principio feedback: La portata dipende dalla concentrazione di biomassa cellulare richiesta all'uscita.

82. Curva di crescita della popolazione durante la coltivazione periodica, che indica le fasi di crescita.

UN) fase di latenza- crescita relativamente lenta della coltura introdotta, sviluppando un nuovo habitat all'interno del bioreattore; B) fase esponenziale- divisione cellulare rapida, crescita equilibrata della coltura; V) fase di crescita lenta associato all'esaurimento dei substrati nutritivi e all'accumulo di prodotti metabolici tossici; G) fase stazionaria- la crescita delle cellule è pari alla loro perdita; D) fase morente- diminuzione graduale del numero di cellule vitali.

83. Come ridurre la fase di ritardo nella produzione.

La fase di latenza viene ridotta (o può essere completamente assente) se le cellule giovani attive della fase di crescita esponenziale vengono trasferite in un mezzo fresco della stessa composizione e temperatura.

84. Qual è la differenza tra tempo di generazione e tempo di raddoppio della biomassa.

Il tempo di generazione è il periodo di raddoppio delle cellule.

Il tempo di raddoppio è il periodo necessario per raddoppiare la biomassa.

Esempio: per le piante: tempo di generazione - 20-70 ore

Tempo di raddoppio – 1-2 settimane

85. Formula per il tasso di crescita assoluto.

Aumento del numero di cellule in un certo periodo di tempo.

86. Tasso di crescita specifico (due formule).

Tasso di crescita specifico µ (crescita cellulare all'ora)

µ=V/x risultato= dx/dt * 1/x

µ=2,3(log X – logXo)/t1-t2

87. Classificazione dei sistemi di coltivazione continua.

Aprire

A) omogeneamente continuo

-singola fase

- multistadio

un semplice

b) complesso

B) eterogeneo - continuo

- tubolare

- controcorrente

2) chiuso( rilevamento meccanico delle cellule)

A) Riciclaggio al 100%.

B) crescita in interfase

88. In quali sistemi si instaura uno stato mobile di equilibrio? (Non sono riuscito a trovare esattamente quali sistemi, solo uguaglianza)

µ= dx/dt*1/x oppure dx/dt = µ*b condizione di coltivazione continua, l'aumento istantaneo della biomassa è compensato dalla sottrazione di biomassa dall'ambiente (Dx), ovvero µx –Dx=0 oppure (μ -D)*x=0, da cui D=μ, questa uguaglianza è la condizione principale per il mantenimento dell'equilibrio.

89.Come funzionano i fermentatori tubolari?

Fermentatore tubolare(gas lift) è costituito da un reattore del tipo a fascio tubiero, attraverso il quale il liquido viene mosso da un flusso d'aria verso la parte superiore dell'apparecchiatura e, entrando nel separatore, ritorna al reattore, dove viene nuovamente trascinato aria, subendo così circolazione.

90. Come funzionano i fermentatori in controcorrente.

Fermentatori a bolle. L'aria viene loro fornita attraverso dispositivi di batage al boro, che si trovano nella parte inferiore del

La coltivazione dei microrganismi è uno dei metodi principali della microbiologia. Il successo del loro studio e dell'applicazione pratica dipende in gran parte dalla capacità di coltivare microrganismi in condizioni di laboratorio. La coltivazione si basa sulla conoscenza delle caratteristiche fisiologiche e biochimiche dei microrganismi e sulla comprensione dell'importanza delle condizioni ambientali fisiche e chimiche per la loro attività vitale.

PRINCIPI DI COMPILAZIONE DEI TERRENI PER LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI

In condizioni di laboratorio, i microrganismi vengono coltivati ​​su terreni nutritivi, quindi il terreno nutritivo deve contenere tutte le sostanze necessarie per la loro crescita. Sono stati proposti centinaia di terreni diversi per la coltivazione di microrganismi, la cui composizione è determinata dalle esigenze dei microrganismi per i composti necessari per la biosintesi e la produzione di energia. I processi costruttivi ed energetici dei microrganismi sono estremamente diversi e quindi le loro esigenze nutrizionali sono altrettanto diverse. Da questa ne consegue che non esistono terreni universali ugualmente adatti alla crescita di tutti i microrganismi senza eccezione.

I componenti principali di qualsiasi mezzo nutritivo per la coltivazione di microrganismi sono i composti del carbonio e dell'azoto. E Sono questi composti che determinano la specificità della stragrande maggioranza dei mezzi nutritivi.

In base al loro fabbisogno di carbonio, i microrganismi sono generalmente divisi in due grandi gruppi: autotrofi ed eterotrofi.

I microrganismi autotrofi sono in grado di utilizzare l'anidride carbonica, un composto contenente carbonio nella sua forma più ossidata, come unica fonte di carbonio. In conformità a ciò, quando si coltivano autotrofi, è necessario fornire alle cellule anidride carbonica, poiché la concentrazione di anidride carbonica nell'aria non supera lo 0,03% e il suo ingresso nell'ambiente attraverso la diffusione non è sufficiente per la crescita intensiva dei microrganismi . Pertanto, ai terreni per la coltivazione degli autotrofi vengono aggiunti bicarbonato di sodio (NaHC) o carbonati, molto spesso carbonato di calcio (CaC). In alcuni casi, attraverso il mezzo viene soffiata aria arricchita artificialmente con l'1-5% di anidride carbonica.

I bisogni dei microrganismi eterotrofi non possono essere soddisfatti solo dall'anidride carbonica. Per il loro sviluppo, l'ambiente deve contenere composti organici. A seconda delle loro caratteristiche individuali, i microrganismi eterotrofi sono in grado di utilizzare vari composti del carbonio: acidi, alcoli, carboidrati, idrocarburi, composti aromatici. Allo stesso tempo, alcuni microrganismi, ad esempio, un certo numero di batteri della famiglia soddisfano i bisogni Pseudotonadaceae, possono accontentarsi di un'ampia gamma di sostanze organiche diverse, mentre altri microrganismi sono caratterizzati da un'elevata specializzazione e dalla capacità di utilizzare solo pochi composti del carbonio, quindi alcuni batteri metanoossidanti utilizzano solo metano e metanolo.

Il secondo componente principale del terreno di coltura è la fonte di azoto. L'azoto fa parte delle sostanze organiche della cellula principalmente in forma ridotta - sotto forma di gruppi amminici (-N) o immino (-NH). Tuttavia, il fabbisogno dei microrganismi per una fonte di azoto può essere soddisfatto da vari composti contenenti azoto, nei quali l'azoto presenta diversi gradi di riduzione. Per molti microrganismi questi possono essere sali di ammonio. In questo caso, ai mezzi viene aggiunto NCl o (N)S. Va tuttavia ricordato che i sali di ammonio sono sali fisiologicamente acidi, poiché quando si utilizza lo ione ammonio, nell'ambiente si accumula l'anione dell'acido corrispondente. Ciò porta ad un notevole aumento dell'acidità dell'ambiente e può influenzare negativamente lo sviluppo dei microrganismi. L'idrossido di ammonio (NNOH) è usato raramente come fonte di azoto, poiché provoca una forte alcalinizzazione dei mezzi nutritivi.

Il fabbisogno di azoto di un numero significativo di microrganismi può essere soddisfatto dai nitrati. I terreni nutritivi per la coltivazione di tali microrganismi contengono KNO o NaNO. A differenza dei sali di ammonio, i nitrati sono sali fisiologicamente alcalini, poiché quando viene utilizzato l'anione NO-, i cationi K+ o Na+ si accumulano nel mezzo. I nitriti sono tossici per molti microrganismi in condizioni acide, quindi non vengono quasi mai utilizzati come fonte di azoto.

I terreni nutritivi per la coltivazione di microrganismi che richiedono più azoto e, di conseguenza, hanno capacità biosintetiche inferiori, devono includere uno, più o un set completo di aminoacidi. I singoli aminoacidi in forma L o DL vengono aggiunti al terreno sterile in una concentrazione compresa tra 0,1 e 0,05 g per 100 ml immediatamente prima dell'inoculazione con microrganismi. Per fare ciò, si consiglia di utilizzare soluzioni di amminoacidi in cui la concentrazione supera di 100 volte il contenuto di amminoacidi nel mezzo. Glicina, alanina, prolina, lisina e ornitina vengono sciolti in acqua distillata, fenilalanina e triptofano vengono sciolti in acqua distillata, alcalinizzata con NaOH, e i restanti amminoacidi vengono sciolti in acqua distillata, acidificata con HCl. Gli aminoacidi - cistina e cisteina, così come le ammidi - glutammina e asparagina sono instabili al calore, quindi vengono sterilizzati mediante filtrazione. Gli aminoacidi rimanenti possono essere sterilizzati a 0,5 atm per 15 minuti.

Il fabbisogno dei microrganismi per diversi aminoacidi viene spesso soddisfatto aggiungendo idrolizzato proteico al terreno. Per ottenere gli idrolizzati vengono utilizzate proteine ​​di origine animale (carne, pesce, gelatina, caseina) o vegetale (soia, semi di girasole), nonché cellule microbiche (lieviti, alghe, batteri). L'idrolisi viene effettuata utilizzando enzimi proteolitici o mediante ebollizione con acidi minerali o alcali acidi. La composizione degli idrolizzati non è la stessa e dipende dal substrato iniziale, nonché dal metodo di preparazione. Molto spesso viene utilizzato l'idrolizzato di caseina, che viene preparato in laboratorio, solitamente mediante idrolisi acida. Per fare questo si versano 20 g di caseina in 200 ml di acqua, si aggiungono 10 ml di HSO concentrato e si mantengono in autoclave per 4 ore a 1,5 atm. Tuttavia, ciò provoca la corrosione delle apparecchiature dell'autoclave, quindi l'idrolizzato di caseina viene spesso ottenuto in modo diverso. A 200 g di caseina aggiungerne 280 ml di soluzione di HCl 6N e la miscela viene posta a riflusso per 18 ore.L'idrolizzato risultante viene neutralizzato con una soluzione di NaOH al 50% a pH 7, filtrato; attraverso un filtro di carta e sterilizzato a 0,5 atm per 30 minuti. Il contenuto di azoto amminico nell'idrolizzato così ottenuto è di 700 - 1000 mg per 100 ml. Viene aggiunto ai mezzi in quantità tali che la concentrazione di azoto amminico sia di 10-30 mg per 100 ml. Questo va tenuto presente Durante l'idrolisi acida, il triptofano viene completamente distrutto, la cisteina viene distrutta in misura abbastanza ampia e la serina e la treonina vengono leggermente distrutte. Esiste una preparazione già pronta di idrolizzato di caseina. Viene aggiunto ai terreni da 0,1 a 1,0 g per 100 ml, a seconda delle esigenze dei microrganismi.

I microrganismi più esigenti vengono coltivati ​​su terreni nutritivi contenenti proteine ​​o prodotti della loro degradazione incompleta: i peptoni. I peptoni sono una miscela di poli e oligopeptidi, amminoacidi, basi azotate organiche, sali e oligoelementi. Si ottengono per azione di enzimi proteolitici su proteine ​​di origine animale (proteine ​​muscolari, caseina) o vegetale (farina di soia). Nei laboratori domestici viene spesso utilizzato il peptone enzimatico prodotto dalla pianta di Semipalatinsk. È una polvere igroscopica di colore giallo chiaro colori, completamente solubili in acqua; Una soluzione all'1% di peptone ha una reazione neutra o leggermente acida. Il peptone viene aggiunto ai terreni nutritivi da 1-2 a 20 g per 1 litro.

Va tenuto presente che i microrganismi possono utilizzare gli aminoacidi e il peptone non solo come fonte di azoto, ma anche come fonte di carbonio ed energia.

Alcuni batteri sono in grado di utilizzare l'azoto molecolare - N - come unica fonte di azoto: questi sono fissatori di azoto. I composti dell'azoto non possono essere aggiunti ai terreni per la coltivazione di tali microrganismi. I fissatori di azoto vengono forniti con azoto gassoso attraverso il contatto del mezzo con l'aria o la coltivazione in atmosfera di azoto.

Oltre alle fonti di carbonio e azoto, molti microrganismi necessitano della presenza nell'ambiente dei cosiddetti fattori di crescita, che comprendono vitamine, purine, pirimidine e aminoacidi. Per sottolineare la necessità dei microrganismi di fattori di crescita, è consuetudine usare i termini “prototrofi” e “auxotrofi”. I prototrofi non necessitano di fattori di crescita; per gli auxotrofi è assolutamente necessaria la presenza di uno o più fattori di crescita nell’ambiente. Questi termini sono particolarmente utilizzati nella letteratura genetica. Se il fabbisogno di fattori di crescita dei microrganismi è limitato da una o più vitamine, si consiglia di aggiungerli ai terreni di coltura utilizzando le seguenti concentrazioni: tiamina (vitamina B), pantotenato di calcio, riboflavina (vitamina B), acido nicotinico ( niacina), piridossina, piridossamina, colina, cobalamina (vitamina B) - 1 mcg per 1 ml di terreno; acido folico e acido n-amminobenzoico - 0,05 μg per 1 ml di terreno; biotina - 0,005 mcg per 1 ml di terreno.

Le vitamine vengono aggiunte al terreno sterile immediatamente prima dell'inoculazione. Per fare ciò, si consiglia di utilizzare soluzioni in cui la concentrazione della vitamina supera di 100 volte il suo contenuto nel mezzo nutritivo. Le soluzioni vengono preparate in contenitori sterili e viene utilizzata acqua distillata sterile. Le eccezioni sono la riboflavina e l'acido folico. La riboflavina viene sciolta in acido acetico 0,02 N e l'acido folico viene sciolto in NaOH 0,01 N, quindi regolato Concentrazione di NaOH in soluzione fino a 0,001 N. Le soluzioni risultanti vengono sterilizzate riscaldando a bagnomaria bollente per 3 minuti. Si consiglia di sterilizzare la soluzione di tiamina mediante filtrazione, poiché la tiamina viene distrutta quando riscaldata. A una temperatura di +4, le soluzioni vitaminiche vengono conservate per almeno un mese. Soluzioni acido folico. La piridossina e la riboflavina vengono conservate al buio perché sono fotosensibili.

Esempi di miscele contenenti fattori di crescita includono estratto di lievito, autolisato di lievito ed estratto di mais. L'estratto di lievito viene aggiunto al terreno di coltura da 0,05 fino a 0,5 g per 100 ml, autolisato di lievito - in quantità tale che la concentrazione di azoto amminico sia 5-30 mg per 100 ml di terreno. Estratto di lievito

disponibile alla vendita. L'autolisato di lievito viene preparato come segue: 40 g di lievito fresco spremuto o 10 g di lievito secco vengono versati con acqua e agitati fino ad ottenere una massa omogenea, quindi vengono aggiunti diversi cristalli di timolo o 1-2 ml di cloroformio e conservati in un termostato a 50-55 per 3 giorni. Durante questo periodo, le cellule del lievito muoiono, ma gli enzimi rimangono attivi e idrolizzano le proteine, così come altri biopolimeri. Dopo 3 giorni, l'autolisato risultante, dopo accurata miscelazione, viene fatto bollire a fuoco basso per 20 minuti e filtrato su pasta di carta utilizzando un imbuto Buchner. Il contenuto di azoto amminico è determinato mediante titolazione formale. L'autolisato di lievito viene sterilizzato a 0,5 atm per 15 minuti e conservato in frigorifero.

L'estratto di mais è un prodotto finito delle fabbriche dell'industria dell'amido e dello sciroppo. Contiene aminoacidi, vitamine, una quantità abbastanza grande di acidi organici (lattico, acetico e formico) e sali minerali. L'estratto di mais viene aggiunto ai terreni da 0,5 a 5 g per 10 ml; sterilizzato a 0,5 atm.

Oltre alle fonti di carbonio, azoto e fattori di crescita, i microrganismi necessitano di zolfo, fosforo e una serie di altri elementi per costruire le sostanze cellulari. Tutti devono essere contenuti in un mezzo nutritivo in una forma accessibile ai microrganismi. Il fabbisogno di zolfo, fosforo e altri elementi della cenere di diversi gruppi di microrganismi è solitamente soddisfatto dai sali minerali. Pertanto, il cosiddetto “fondo minerale” dei terreni per la coltivazione di molti microrganismi può avere una composizione simile. Pertanto, il fabbisogno di zolfo della stragrande maggioranza dei microrganismi è soddisfatto dai solfati, sebbene nella cellula lo zolfo si trovi principalmente in forma ridotta, sotto forma di gruppi sulfidrilici. I microrganismi che richiedono la presenza di zolfo ridotto nell'ambiente sono molto meno comuni. In questo caso, al terreno vengono aggiunti solfuri, molto spesso NaS, o composti organici contenenti gruppi sulfidrilici, come la cisteina.

I sali di acido fosforico soddisfano il fabbisogno di fosforo dei microrganismi. Tutti i metalli necessari - K, Na, Ca, Mg, Fe, Mn, Co, Cu - e altri elementi sono ottenuti da microrganismi sotto forma di cationi o anioni di sali inorganici. Ad esempio, la fonte di magnesio è MgSO, la fonte di sodio e cloro è NaCl, il calcio è CaCO o CaCl. Il ferro viene aggiunto ai media sotto forma di cloruro, solfato o citrato.

Per evitare precipitazioni dovute alla formazione di complessi fosfatici insolubili con alcuni cationi, soprattutto ferro e calcio, si consiglia di aggiungere da 0,001 a 1 g/l di etilendiamminotetraacetato (EDTA) o di esametafosfato di sodio ad una concentrazione di 4 g/l ai media. I complessi formati da questi composti con i cationi fungono da riserva dalla quale i cationi liberi entrano nella soluzione a seguito della dissociazione.

Sono necessari relativamente potassio, magnesio, calcio e ferro grandi quantità, quindi i loro sali sono solitamente inclusi nei mezzi nutritivi. Il fabbisogno dei microrganismi per manganese, molibdeno, zinco, rame e cobalto è molto ridotto. Questi elementi, spesso chiamati microelementi, vengono aggiunti ai media da 1 mg fino a l µg per 1 litro; concentrazioni più elevate possono essere tossiche. I terreni nutritivi con peptone, estratto di terreno, estratto di lievito, idrolizzato di caseina contengono i microelementi necessari. Dovrebbero essere aggiunti a terreni sintetici preparati con acqua distillata. Poco si sa circa le concentrazioni ottimali di microelementi per i diversi microrganismi; pertanto sono state proposte miscele di microelementi di diversa composizione.

Miscela di microelementi secondo Drews (Drews, 1976), mg: EDTA Na-800; MnCl*4HO-10; CoCl*6HO-4; CuSO-1; NaMoO*2HO-3;ZnCl-2; LiCl - 0,5; SnCl*2H0;- 0,5; NVO-1, KVg-2; KJ-2; BaCl-0,5; acqua distillata - 1000 ml; pH 6,0. Aggiungere da 5 a 10 ml di questa soluzione per 1 litro di terreno.

Miscela di microelementi secondo Pfennig (Pfennig, 1965), mg: EDTA-500; FeSO*7HO-200; ZnSO*7 HO-10; MnCl.4 HO-3; HBO-30 ; CoCl*2HO - 20 ; CuCl*2HO-1; NiCl*6HO-2; NaMoO*2 HО - 3; acqua distillata - 1000 ml. Aggiungere da 1 a 10 ml per 1 litro di terreno questa soluzione. Si consiglia di sterilizzare separatamente le soluzioni di microelementi e di aggiungerle al terreno immediatamente prima dell'inoculo.

I terreni nutritivi per la coltivazione dei microrganismi, oltre ai composti necessari per i processi di biosintesi, devono includere anche materiale energetico. Secondo il metodo per ottenere energia, tutti i microrganismi sono solitamente divisi in due gruppi principali: chemiotrofi e fototrofi.

I chemiotrofi utilizzano l'energia dell'ossidazione di vari composti. A seconda del substrato ossidato (donatore di idrogeno), tra gli organismi chemiotrofi si distinguono chemiolitotrofi e chemioorganotrofi. I primi ossidano composti inorganici come HS, S o altri composti solforati non completamente ossidati, H, NH+, NO- o Fe. Questi composti nei terreni per la coltivazione di batteri chemiolitotrofi svolgono principalmente la funzione di materiale energetico. Per i chemioorganotrofi, il substrato energetico sono le sostanze organiche, che di solito svolgono un duplice ruolo, essendo sia una fonte di carbonio che una fonte di energia. Tuttavia, ci sono microrganismi che richiedono composti diversi per processi costruttivi ed energetici. Ad esempio, i batteri lattici omofermentanti ottengono energia dalla fermentazione degli zuccheri, ma quasi non la utilizzano nei processi di biosintesi. Per scopi costruttivi necessitano di aminoacidi già pronti, basi purine o pirimidiniche e vitamine.

I fototrofi utilizzano l'energia luminosa. Per soddisfare il fabbisogno energetico di questi batteri, vengono coltivati ​​alla luce del giorno o artificiale.

In base alla composizione si è soliti distinguere tra mezzi naturali o naturali di composizione incerta e mezzi sintetici.

Naturale solitamente indicati come supporti costituiti da prodotti di origine animale o vegetale. Tali mezzi includono succhi di frutta o verdura, tessuti animali, sangue diluito, latte, acqua di mare, laghi e sorgenti minerali, decotti o estratti ottenuti da substrati naturali come carne, terreno, letame, varie parti di piante e cellule microbiche.

Molti microrganismi si sviluppano bene su terreni naturali, poiché tali terreni contengono tutti i componenti necessari per la crescita e lo sviluppo. Tuttavia, questi terreni hanno una composizione chimica complessa e variabile e sono di scarsa utilità per lo studio del metabolismo dei microrganismi, poiché è difficile tenere conto del consumo di un numero di componenti e della formazione di prodotti metabolici. I terreni naturali vengono utilizzati principalmente per il mantenimento delle colture microbiche, l'accumulo di biomassa e per scopi diagnostici. I terreni naturali ampiamente utilizzati nella pratica di laboratorio includono brodo di carne e peptone, mosto di birra non luppolato, terreni per lievito e patate ed estratto di terreno.

Brodo di carne - peptone (MPB). La base per la sua preparazione è l'acqua di carne, che solitamente viene preparata come segue: 500 g di carne, liberata da ossa, grasso e tendini, vengono tritati finemente o passati al tritacarne, versati in 1 litro di acqua del rubinetto e lasciati a temperatura ambiente. temperatura per 12 ore o in termostato a trenta per 6 ore e a 37 - per 2 ore, durante questo periodo dalla carne vengono estratte varie sostanze, comprese le vitamine idrosolubili. Quindi la carne viene strizzata attraverso una garza e l'infuso risultante viene fatto bollire per 30 minuti. In questo caso le proteine ​​coagulano. La massa raffreddata viene filtrata su filtro di cotone e addizionata con acqua al volume originale. A All'acqua della carne vengono aggiunti l'1% di peptone e lo 0,5% di NaCl.

L'MPB è un ricco mezzo nutritivo, ma non contiene quasi carboidrati. Se necessario, vengono aggiunti all'MPB molto spesso in una quantità di 1-2 g per 100 ml. MPB è sterilizzato a 1 atm.

Il mosto di malto (birra non luppolata) è un buon ambiente per alcuni batteri lattici e acetici, lieviti, funghi microscopici e altri rappresentanti di microrganismi eterotrofi. I componenti principali del mosto sono i carboidrati (fino al 90% della massa totale del residuo secco) e composti contenenti azoto (fino al 6-7% della massa totale del residuo secco). Tra i carboidrati, le quantità maggiori contengono maltosio e destrine. Il mosto contiene vitamine, principalmente del gruppo B, acidi organici e sali minerali.

Il mosto viene preparato come segue. In 1 litro di acqua del rubinetto si versano 250 g di malto macinato, si scalda a 48 - 50 e si mantiene a questa temperatura per mezz'ora, mescolando continuamente il composto per evitare la formazione di grumi. Nella mezz'ora successiva la temperatura viene aumentata a 55-58 e mantenuta a questo livello fino a quando l'amido non è completamente saccarificato, cioè fino a quando la reazione della miscela raffreddata con lo iodio è negativa. In questa modalità avviene anche l'idrolisi delle proteine ​​in amminoacidi e peptidi. L'estratto risultante viene filtrato attraverso pasta di carta o cotone idrofilo. La concentrazione di zucchero nel filtrato viene determinata utilizzando un idrometro Balling, i cui gradi (B) corrispondono approssimativamente alla percentuale di zucchero nel mosto. Il mosto viene portato alla forza desiderata con acqua di rubinetto. Per la coltivazione di funghi microscopici, viene spesso utilizzato il mosto 3-4B, per il lievito - 6-8B e per i batteri lattici più esigenti - mosto 8-12B. Il mosto viene sterilizzato a 0,5 atm per 30 minuti.

Il terreno di lievito viene utilizzato principalmente per coltivare un numero di microrganismi eterotrofi. La base del mezzo di lievito è l'acqua di lievito. Per prepararlo si fanno bollire 70 - 100 g di pressato fresco o 7 - 10 g di lievito secco in 1 litro d'acqua per 30 minuti e dopo che le cellule di lievito si sono depositate, il liquido viene travasato o filtrato con un batuffolo di cotone. Aggiungere 1 litro d'acqua al filtrato, far bollire nuovamente per 30 minuti e filtrare nuovamente. A 100 ml dell'acqua di lievito risultante aggiungere 1-2 g di carboidrati e sali minerali, molto spesso KHPO (0,1 g) e NaCl (0,5 g). Regolare il pH del mezzo a 6,8-7,2. Il terreno viene sterilizzato a 0,5 atm per 20 - 30 minuti.

Il terreno di patata viene utilizzato principalmente per la coltivazione di batteri sporigeni, rappresentanti del genere Caulobacter e alcuni altri batteri chemioorganotrofi. Per preparare questo terreno, tagliare a fettine 200 g di patate accuratamente lavate e sbucciate, aggiungere 1 litro di acqua del rubinetto e far bollire per 20 - 30 minuti. Il brodo viene filtrato su un batuffolo di cotone, il volume del filtrato viene regolato su 1 litro e versato in recipienti per la coltivazione. Il terreno viene sterilizzato per 1 ora a 1 atm o 30 minuti a 1,5 atm.

L'estratto del suolo viene utilizzato principalmente per coltivare vari rappresentanti della microflora del suolo. Per prepararlo si versano 500 g di terreno fertile in 1,5 litri di acqua di rubinetto e si autoclavano a 1 atm per 30 minuti. L'estratto risultante viene filtrato su un filtro di carta, al filtrato caldo vengono aggiunti 0,5 g di CaCO, mescolato accuratamente e filtrato nuovamente dopo 5-7 minuti. Di norma, all'estratto vengono aggiunti 0,2 g di KHPO ogni 1000 ml. Sterilizzare a 1 atm.

Mezzi sintetici- si tratta di mezzi che contengono solo composti di una certa composizione chimica, assunti in quantità precisamente specificate. I media sintetici sono ampiamente utilizzati nello studio del metabolismo, della fisiologia e della biochimica dei microrganismi. Per sviluppare la composizione di mezzi sintetici che garantiscano la crescita di microrganismi o una biosintesi potenziata di qualsiasi prodotto di scarto, è necessario conoscere le caratteristiche metaboliche di un dato organismo e le sue esigenze di fonti alimentari. Attualmente, i microbiologi hanno a disposizione un numero sufficiente di terreni sintetici di qualità non inferiore ai terreni naturali di composizione incerta. I media sintetici possono avere un insieme relativamente ampio di componenti, ma possono anche essere piuttosto semplici nella composizione. Le ricette per alcuni terreni sintetici sono fornite nell'appendice.

Insieme ai media naturali e sintetici, ci sono i cosiddetti mezzi semisintetici. I componenti principali dei terreni semisintetici sono composti di composizione chimica nota: carboidrati, sali o nitrati di ammonio, fosfati, ecc. Tuttavia, la loro composizione comprende sempre sostanze di composizione incerta, come autolisato di lievito, estratto di terreno o idrolizzato di caseina. Questi terreni sono ampiamente utilizzati nella microbiologia industriale per ottenere aminoacidi, vitamine, antibiotici e altri importanti prodotti di scarto dei microrganismi.

Va tenuto presente che gli ambienti che garantiscono un buon sviluppo dei microrganismi sono sempre adatti a risolvere altri problemi di ricerca e pratici, poiché non in tutti i casi l'accumulo di un prodotto di scarto - un enzima, una vitamina, un antibiotico, ecc., va parallelamente a l’accumulo di biomassa.

Spesso, con un'abbondante crescita di microrganismi, il prodotto metabolico desiderato quasi non si forma o si forma in quantità insufficiente. Per fornire la connessione richiesta nella massima quantità possibile, vengono utilizzati supporti speciali. La selezione della concentrazione e del rapporto dei componenti del mezzo viene effettuata utilizzando metodi di pianificazione matematica degli esperimenti, descritti in modo sufficientemente dettagliato nel libro di V. N. Maksimov (1980).

Ambienti elettivi progettati per isolare i microrganismi dai loro habitat naturali. Garantiscono prevalentemente lo sviluppo di un determinato gruppo di microrganismi, caratterizzati da proprietà fisiologiche comuni. Leggi di più su in questi ambienti, vedi pag. 108 - 109.

Ambienti diagnostici differenziali (indicativi). Dare

La capacità di distinguere rapidamente un tipo di microrganismo da un altro altri o identificare alcune delle loro caratteristiche. Un esempio di terreno indicatore per identificare batteri del gruppo Escherichia coli in substrati naturali è il terreno Endo agar della seguente composizione, g: peptone-10; lattosio-10; KHPO -3,5; NaHsO-2,5; agar - 150; acqua distillata - 1000 ml; pH 7,4. Al terreno vengono aggiunti 4 ml di una soluzione alcolica al 10% di fucsina basica. Il terreno viene sterilizzato a 1 atm per 15 minuti e conservato al buio. Batteri del genere Escherichia su questo terreno formano colonie cremisi con lucentezza metallica.

Quando si determina la specie di batteri, vengono utilizzati mezzi indicatori di pH che contengono uno degli indicatori: rosso neutro (0,0005%), rosso fenolo (0,005%) o blu di bromotimolo (0,0005%) . Se lo sviluppo di microrganismi è accompagnato dalla formazione di acidi o alcali, il colore dell'indicatore cambia.I terreni diagnostici differenziali sono particolarmente utilizzati nella microbiologia sanitaria e medica per identificazione rapida di alcuni gruppi di microrganismi.

In base al loro stato fisico si distinguono mezzi liquidi, granulari e densi.

Mezzi liquidi Sono ampiamente utilizzati per l'accumulo di biomassa o prodotti metabolici, per lo studio della fisiologia e della biochimica dei microrganismi, nonché per il mantenimento e la conservazione nella raccolta di colture di microrganismi che non si sviluppano bene su terreni solidi.

Supporti sfusi utilizzato principalmente nella microbiologia industriale per coltivare alcuni produttori di composti fisiologicamente attivi, nonché in collezioni per preservare colture di microrganismi. Tali mezzi includono, ad esempio, miglio bollito, crusca, sabbia di quarzo imbevuta di una soluzione nutritiva.

Mezzi densi utilizzato per isolare colture pure, per scopi diagnostici per descrivere colonie, per determinare il numero di microrganismi, la loro attività antibiotica, per conservare colture in collezioni e in una serie di altri casi. Agar o gelatina vengono utilizzati per compattare i media. Le piastre di silicato, impregnate con un mezzo nutritivo, possono fungere da base densa.

Figura 41. Preparazione degli slant di agar in provette

L'agar viene spesso utilizzato soprattutto per compattare i supporti. È un polisaccaride complesso contenente saccarosio e agaropectina. Oltretutto. L'agar include una piccola quantità di sostanze facilmente assimilabili e sali vari. L'agar si ottiene da alcune alghe e si presenta sotto forma di placche, steli o polvere. L'agar è conveniente perché la maggior parte dei microrganismi non lo utilizza come substrato per la crescita. In acqua forma un gel che fonde a circa 100°C ed indurisce a 40°C.

Pertanto, una parte significativa dei microrganismi attualmente conosciuti può essere coltivata su terreni agarizzati.

Molto spesso, l'agar viene aggiunto ai terreni in una quantità dell'1,5%. Se è necessario ottenere un ambiente più umido aggiungere l'1,0% e un ambiente più denso e secco aggiungere il 2-3% di agar. Il mezzo di agar viene riscaldato a bagnomaria bollente finché non si scioglie completamente. Se si suppone che i microrganismi vengano coltivati ​​su un terreno di agar inclinato in provette, ciascuna provetta viene riempita con non più di 1/3 del terreno. Per evitare che il terreno si secchi, viene falciato dopo la sterilizzazione, prima della semina. A tale scopo, le provette con il mezzo sciolto in un bagnomaria bollente vengono poste in posizione inclinata (Fig. 41) e il mezzo viene lasciato solidificare. Il terreno di agar inclinato non deve raggiungere i 4-6 cm fino al tampone di cotone.Il terreno destinato alla coltivazione dei batteri nelle piastre Petri viene versato in provette da 20-25 ml di volume maggiore rispetto al terreno di agar inclinato o sterilizzato in fiasche. In quest'ultimo caso l'agar non viene sciolto prima della sterilizzazione.

Quando il terreno agarizzato si raffredda, si forma acqua di condensa. Minore è la concentrazione di agar, maggiore è la quantità di acqua rilasciata. Pertanto, quando si coltivano microrganismi sulla superficie di terreni agarizzati in piastre Petri, per ottenere colonie isolate, le piastre vengono poste in un termostato con i coperchi abbassati. In caso contrario, all'interno del coperchio si accumula della condensa che, colando sulla superficie del terreno, interferisce con la produzione di colonie isolate.

L'agar è leggermente alcalino, quindi la sua aggiunta può portare ad un leggero aumento del pH. In ambienti leggermente acidi, neutri o leggermente alcalini, l'agar conserva la capacità di formare un gel dopo diversi cicli di fusione e solidificazione e anche dopo ripetute sterilizzazioni. Bisogna però ricordare che quando il pH del terreno è inferiore a 5,5, l'agar viene parzialmente idrolizzato durante la sterilizzazione e quindi perde la capacità di formare gel, cioè non indurisce. In questo caso, viene sterilizzato separatamente dal mezzo in un certo volume d'acqua, sciolto a bagnomaria e versato sotto agitazione costante in un mezzo sterile preriscaldato.

L'agar, come accennato in precedenza, contiene impurità di sostanze organiche e minerali, talvolta indesiderabili. Per eliminarne la maggior parte, procedere come segue. L'agar viene riempito con acqua di rubinetto e posto in un termostato a 30-37. Le impurità vengono lavate nell'acqua e decomposte dai microrganismi che si sviluppano in essa. Dopo un giorno o due si scarica il liquido, si lava più volte l'agar con acqua dolce, si riempie nuovamente d'acqua e si rimette nel termostato. Quando quest'acqua diventa torbida, viene nuovamente sostituita con una nuova, e questo viene fatto fino a quando l'odore scompare e l'acqua smette di diventare torbida. Tipicamente dopo 2-3 settimane si ottiene un agar quasi privo di sostanze organiche e minerali solubili. Si scola l'acqua, si mette l'agar in un sacchetto di doppia garza e si lava con acqua corrente di rubinetto per 2-3 giorni, quindi si stende in uno strato sottile e si fa essiccare all'aria o in forno a 40-50.

La gelatina è un estratto ottenuto da substrati ricchi di collagene - la proteina di ossa, cartilagine, tendini, squame. Il gel formato dalla gelatina si scioglie ad una temperatura di 25 ° C, che è inferiore alla normale temperatura di incubazione di molti microrganismi (30 - 37 ° C). Inoltre, la gelatina viene liquefatta da enzimi proteolitici, che molti microrganismi secernono nel mezzo. Queste proprietà della gelatina ne limitano l'uso come agente compattante. La gelatina viene utilizzata principalmente per scopi diagnostici - per rilevare l'attività proteolitica dei microrganismi , nonché per ottenere colonie di lievito giganti e profonde: nel primo caso si utilizza la carne - peptone, nel secondo - gelatina di mosto.

Il 10-20% di gelatina viene aggiunto al mezzo liquido, lasciato gonfiare per 5-10 minuti e riscaldato a bagnomaria fino alla dissoluzione. Regolare il pH del terreno su 6,8-7,0. La gelatina è acida e ha un'elevata capacità tampone, quindi per la neutralizzazione viene utilizzata più alcali che, ad esempio, per neutralizzare l'MPA. I supporti di gelatina vengono sterilizzati a 0,5 atm per 15 minuti o frazionalmente - 3 volte per 20 minuti in una caldaia Koch. La sterilizzazione ripetuta dei supporti di gelatina, soprattutto quando il pH dei supporti è inferiore a 6,0 o superiore a 7,3, non è consigliata, poiché la gelatina viene parzialmente idrolizzata e perde le sue proprietà di formazione del gel.

Il gel di silice (gel di silice) viene utilizzato come base solida per supporti sintetici con composizione rigorosamente definita.

Il gel viene preparato come segue. Alla densità dell'acido cloridrico

1.1 aggiungere, sotto agitazione, un uguale volume di soluzione di vetro liquido (NaSiO o KSiO) della stessa densità.La miscela viene versata in piastre Petri, da 20-30 ml ciascuna, e le piastre vengono lasciate su una superficie orizzontale per diverse ore fino a quando si forma un gel di acido silicico. Quando il gel diventa denso, le coppe aperte vengono poste in un recipiente di vetro o smalto, lavate per 2-3 giorni con acqua corrente per eliminare i cloruri, e poi più volte con acqua distillata calda. L'assenza di cloruri si valuta mediante un campione qualitativo di acqua di lavaggio con una soluzione di nitrato d'argento all'1 - 5%: in presenza di cloruri si forma un precipitato bianco. Le piastre, lavate dal cloro, vengono immerse in 2-3 ml di un mezzo concentrato, il contenuto di componenti in cui è 5-10 volte superiore rispetto al corrispondente mezzo liquido. Successivamente le coppe con le piastre di gel vengono poste aperte in un armadio di asciugatura e asciugate a 50-60, assicurandosi che il gel non si crepi e la sua superficie rimanga umida. Se necessario, le tazze vengono avvolte in carta e, senza girarle, sterilizzate in autoclave a 0,5 atm per 15 minuti. Le piastre destinate all'isolamento e alla coltivazione di batteri autotrofi non necessitano di essere sterilizzate. Solo il mezzo con cui è impregnato il gel viene sterilizzato. Le tazze con piastre in gel di silice vengono conservate sott'acqua fino al momento dell'uso.

Alcune caratteristiche specifiche dell'agar, della gelatina e del gel di acido silicico sono riassunte nella Tabella 3.

Tabella 3.-Caratteristiche principali delle sostanze utilizzate per compattare i mezzi nutritivi

Va ricordato che tutti i terreni con agar o gelatina devono essere classificati come terreni naturali di composizione indeterminata.

Chiarimento dei media. Per alcuni studi speciali sono necessari terreni di agar chiarificato o gelatina, ad esempio per ottenere colonie isolate chiaramente visibili di microrganismi anaerobici.

In alcuni casi, può esserlo un mezzo trasparente si ottiene filtrandolo dal sedimento attraverso un batuffolo di cotone assorbente. Quando ciò non basta, i mezzi vengono chiarificati utilizzando l'albume d'uovo. Per schiarire 500 ml È sufficiente l'albume di un uovo. Si separa l'albume dal tuorlo e lo si agita con un uguale volume d'acqua fino a formare una schiuma solida. La proteina montata viene versata in un mezzo precedentemente sciolto e raffreddato a 45-50. Prima di aggiungere proteine, controllare il pH e, se necessario, alcalinizzare il terreno a pH 7,0-7,3. Il mezzo con la proteina viene accuratamente miscelato e riscaldato a 100 in un'autoclave o in una caldaia Koch per un'ora. La proteina coagula e adsorbe tutte le particelle sospese nel mezzo. Quando la proteina coagulata risale in superficie o affonda, il mezzo viene rapidamente filtrato a caldo attraverso un batuffolo di cotone. In questo caso è conveniente utilizzare supporti per imbuti appositamente riscaldati, che impediscono la solidificazione del mezzo durante il filtraggio.

I terreni di agar sintetici, nei quali non è desiderabile aggiungere proteine, vengono chiariti come segue. Il terreno viene versato in un bicchiere, autoclavato e lasciato dopo la sterilizzazione in un'autoclave chiusa per 10-12 ore, solitamente durante la notte. Con un raffreddamento così lento, tutte le particelle sospese si depositano sul fondo. Il mezzo di agar congelato viene rimosso dal vetro, la parte superiore trasparente viene tagliata, posta in un pallone e nuovamente sterilizzata.

I piatti destinati alla preparazione dei terreni e alla coltivazione di microrganismi non devono contenere sostanze estranee. È meglio usare contenitori di vetro. Nuovo cristalleria lavato e immerso per una notte in una soluzione all'1-2% di acido cloridrico o solforico, quindi lavato più volte con acqua ed essiccato. A volte, lavorare con microelementi, vitamine, materiali sintetici e altri richiede una pulizia particolarmente accurata delle stoviglie. I mezzi naturali di composizione incerta possono essere preparati in piatti smaltati.

Non preparare grandi scorte di supporti per un uso futuro, poiché si seccano, si concentrano e diventano inutilizzabili. Conservare i supporti in un luogo fresco, protetto dalla luce e non troppo umido. In condizioni umide, i tamponi di cotone si saturano di umidità e il micelio di funghi microscopici può crescere attraverso di essi. Ogni recipiente con il mezzo deve avere un'etichetta che indica la composizione (nome) del mezzo e il tempo della sua preparazione.

Uno strumento universale per la produzione dei raccolti è un ciclo batterico. Oltre a questo, per l'inoculazione mediante iniezione viene utilizzato uno speciale ago batterico e per l'inoculazione su piastre Petri vengono utilizzate spatole di metallo o di vetro. Per le colture materiali liquidi Insieme all'ansa vengono utilizzate pipette Pasteur e graduate. I primi sono prefabbricati con tubi di vetro sterili a basso punto di fusione, che vengono aspirati dalla fiamma sotto forma di capillari. L'estremità del capillare viene immediatamente sigillata per mantenerne la sterilità. Per le pipette Pasteur e graduate, l'estremità larga viene ricoperta con un batuffolo di cotone, dopodiché vengono riposte in apposite custodie o avvolte in carta e sterilizzate.

Quando si risemina una coltura batterica inserire una provetta mano sinistra, e con la mano destra, afferrando con le dita IV e V il tampone di cotone, toglierlo portandolo sopra la fiamma del bruciatore. Tenendo l'ansa con le altre dita della stessa mano, utilizzarla per raccogliere l'inoculo, quindi chiudere la provetta con un tappo. Quindi si introduce un'ansa con l'inoculo nella provetta con l'agar inclinato, abbassandola fino al condensato nella parte inferiore del terreno, e il materiale viene distribuito con un movimento a zigzag sulla superficie inclinata dell'agar. Tolto l'ansa, bruciare il bordo della provetta e chiuderla con un tappo. L'anello viene sterilizzato sulla fiamma di un bruciatore e posizionato su un treppiede. Le provette con le colture sono scritte sopra d, indicando la data di semina e la natura dell'inoculo (numero del test o nome della coltura).

Semina con prato prodotto con una spatola su agar nutriente in una capsula Petri. Per fare ciò, aprire leggermente il coperchio con la mano sinistra e applicare il materiale del seme sulla superficie dell'agar nutriente utilizzando un'ansa o una pipetta. Quindi passare la spatola attraverso la fiamma del bruciatore, raffreddarla all'interno del coperchio e strofinare il materiale su tutta la superficie del supporto. Dopo l'incubazione dell'inoculazione appare una crescita uniforme e continua di batteri.

Affinché una coltura di microrganismi possa crescere, moltiplicarsi ed eseguire normalmente la biosintesi di qualsiasi sostanza, sono necessarie condizioni ambientali favorevoli. In condizioni sfavorevoli, le proprietà dei microrganismi cambiano, la loro attività vitale viene soppressa o si verifica la morte. In condizioni sfavorevoli, le proprietà dei microrganismi cambiano, la loro attività vitale viene soppressa o si verifica la morte.

Fisico– temperatura, umidità ambientale, concentrazione di nutrienti.

A fattori chimici che influenzano l'attività vitale dei microrganismi includono: pH dell'ambiente, potenziale redox (rH2) e presenza di sostanze tossiche nell'ambiente.

Fattori biologici – si riducono al rapporto tra i microrganismi che entrano in contatto durante la loro attività vitale.

Proprietà culturali dei batteri– bisogni nutrizionali, condizioni di crescita e modelli di crescita dei batteri sui batteri. ambienti In fattori nutrizionali, azoto e crescita, la capacità dei batteri di crescere su determinati mezzi nutritivi, in condizioni di crescita: pH, Eh, concentrazione di O2, densità, pressione osmotica del mezzo, temperatura di crescita; nella natura della crescita: il tasso di crescita (veloce, lento), l'aspetto del prodotto in mezzi liquidi, solidi e semiliquidi, i cambiamenti che si verificano nel mezzo o nei suoi singoli componenti durante la crescita dei microbi. Informazioni su K.s. utilizzato nella scelta dei metodi di coltivazione e nell'identificazione della pianta isolata

30. Principi e metodi per isolare colture pure di batteri aerobici e anaerobici.

Una coltura pura è una popolazione di batteri di una specie o di una varietà coltivata su un mezzo nutritivo. Molti tipi di batteri sono divisi in base a una caratteristica in varianti biologiche: biovar (syn: biotipi). I biovar che differiscono nelle proprietà biochimiche sono chiamati chemovar, nelle proprietà antigeniche - sierovar e nella sensibilità ai fagi - phagevar. Colture di microbi della stessa specie, o biovar, isolati da fonti diverse o in tempi diversi dalla stessa fonte sono chiamati ceppi, che di solito sono indicati da numeri o da alcuni simboli. Colture pure di batteri nei laboratori batteriologici diagnostici sono ottenute da colonie isolate mediante sottocoltura con un'ansa in una provetta con un mezzo nutritivo solido o, meno comunemente, liquido.

Una colonia è un accumulo isolato di batteri di una specie, o biovar, cresciuto su un mezzo nutritivo denso come risultato della moltiplicazione di una o più cellule batteriche. Colonie di batteri tipi diversi differiscono tra loro per morfologia, colore e altre caratteristiche.

Si ottiene una coltura pura di batteri per studi diagnostici, che consistono nell'identificazione, cioè nella determinazione del genere e della specie dei batteri isolati. Ciò si ottiene studiando le loro caratteristiche morfologiche, culturali, biochimiche e di altro tipo (vedi Schema 1).

I segni morfologici e tintoriali dei batteri vengono studiati mediante esame microscopico di strisci colorati con diversi metodi e preparati nativi.

Le proprietà culturali caratterizzano le esigenze nutrizionali, le condizioni e il tipo di crescita dei batteri su mezzi nutritivi solidi e liquidi. Queste proprietà sono stabilite dalla morfologia delle colonie e dalle caratteristiche di crescita della coltura.

Le caratteristiche biochimiche dei batteri sono determinate da un insieme di enzimi costitutivi e inducibili inerenti ad un particolare genere, specie o variante. Nella pratica batteriologica, le caratteristiche saccarolitiche e proteolitiche dei batteri, determinate su terreni diagnostici differenziali, sono spesso di importanza tassonomica.

Per identificare i batteri in base al genere e alla specie, i pigmenti sono importanti, poiché colorano colonie e colture in una varietà di colori. Ad esempio, il pigmento rosso è prodotto da Serratia marcescens (meraviglioso bastoncino di sangue), il pigmento dorato da Staphylococcus aureus (staphylococcus aureus) e il pigmento blu-verde da Pseudomonas aeruginosa (bastoncino di pus blu-verde).

Per stabilire la biovar (chemovar, sierovar, tipo fagico), vengono effettuati ulteriori studi per eseguire il marcatore corrispondente: determinazione dell'enzima, dell'antigene, della sensibilità ai fagi.

31. Microflora del suolo, dell'acqua, dell'aria. Specie patogene che persistono nell'ambiente esterno e si trasmettono attraverso il suolo, l'acqua, il cibo e l'aria.

Il suolo. A seconda della profondità dello strato di terreno, cambia anche la composizione della sua microflora. Negli strati superiori, ricchi di resti vegetali e animali e ben forniti di aria, predominano microrganismi aerobici, capaci di decomporre composti organici complessi. Gli strati più profondi del suolo contengono meno composti organici e aria, con conseguente predominanza di batteri anaerobici.

Il suolo funge da habitat per i bastoncini sporigeni dei generi Bacillus e Clostridium. I bacilli non patogeni (Bac. megatherium, Bac. subtilis, ecc.), Insieme agli pseudomonadi, Proteus e alcuni altri batteri, sono ammonificanti, formando un gruppo di batteri putrefattivi che mineralizzano le proteine. I bacilli patogeni (l'agente eziologico dell'antrace, del botulismo, del tetano, della cancrena gassosa) possono persistere a lungo nel terreno.

Ci sono anche numerosi rappresentanti di funghi nel terreno. I funghi partecipano ai processi di formazione del suolo, alla trasformazione dei composti azotati e alla secrezione biologica sostanze attive, compresi antibiotici e tossine. I funghi che producono tossine, quando entrano nel cibo umano, causano intossicazione: micotossicosi e aflatossicosi.

Microflora dell'acqua riflette la composizione microbica del terreno, poiché i microrganismi entrano nell'acqua principalmente con le sue particelle. Alcune biocenosi si formano nell'acqua con una predominanza di microrganismi che si sono adattati alle condizioni di posizione, illuminazione, grado di solubilità dell'ossigeno e anidride carbonica, contenuto di sostanze organiche e minerali.

Nelle acque dei bacini freschi si trovano diversi batteri: bastoncellari (pseudomonas, aeromonas), coccoidi (micrococchi) e contorti. L'inquinamento dell'acqua con sostanze organiche è accompagnato da un aumento dei batteri anaerobici e aerobici, nonché dei funghi. La microflora dell'acqua svolge il ruolo di fattore attivo nel processo di autodepurazione dei rifiuti organici, che vengono utilizzati dai microrganismi. I rappresentanti della normale microflora umana e animale (Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Clostridia) e gli agenti patogeni delle infezioni intestinali (febbre tifoide, paratifo, dissenteria, colera, leptospirosi, infezioni enterovirali) entrano con le acque reflue. Pertanto, l’acqua è un fattore di trasmissione degli agenti patogeni di molte malattie infettive. Alcuni agenti patogeni possono moltiplicarsi anche nell'acqua (Vibrio cholera, Legionella).

Microflora aerea interconnesso con la microflora del suolo e dell'acqua. I microrganismi entrano nell'aria anche attraverso le vie respiratorie e con le gocce di saliva dell'uomo e degli animali. I raggi solari e altri fattori contribuiscono alla morte della microflora aerea. Nell'aria si trovano batteri coccoidi e bastoncelli, bacilli e clostridi, attinomiceti, funghi e virus. Nell'aria degli spazi chiusi sono contenuti numerosi microrganismi, la cui contaminazione microbica dipende dal grado di pulizia della stanza, dal livello di illuminazione, dal numero di persone nella stanza, dalla frequenza della ventilazione, ecc. Il numero di microrganismi in 1 m3 di aria (il cosiddetto numero microbico, o contaminazione dell'aria) riflette le condizioni sanitarie e igieniche dell'aria, soprattutto negli ospedali e negli istituti pediatrici. Indirettamente, il rilascio di microrganismi patogeni (agenti causali di tubercolosi, difterite, pertosse, scarlattina, morbillo, influenza, ecc.) Quando si parla, si tossisce, si starnutisce di pazienti e portatori può essere giudicato dalla presenza di batteri indicatori sanitari (Staphylococcus aureus e streptococchi), poiché questi ultimi sono rappresentanti della microflora del tratto respiratorio superiore e hanno una via di escrezione comune con microrganismi patogeni trasmessi da goccioline trasportate dall'aria.

32. Microrganismi indicatori sanitari. Se - titolo, se - indice, metodi di determinazione.

Gli indicatori sanitari sono microrganismi che possono essere utilizzati per valutare indirettamente e con un grado di probabilità ancora maggiore la possibile presenza di agenti patogeni nell'ambiente esterno.

La loro presenza indica che l'oggetto è contaminato da secrezioni umane e animali, poiché vivono costantemente negli stessi organi degli agenti patogeni e hanno una via comune di rilascio nell'ambiente. Ad esempio, i patogeni delle infezioni intestinali hanno una via di escrezione comune (con le feci) con batteri indicativi di salute come i batteri del gruppo Escherichia coli - (il gruppo comprende batteri dei generi Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella con proprietà simili), enterococchi e Clostridia perfrigens. Gli agenti causali delle infezioni aerodisperse hanno una via di escrezione comune con i batteri (cocchi) che vivono costantemente sulla mucosa del tratto respiratorio superiore e vengono rilasciati nell'ambiente (quando si tossisce, si starnutisce, si parla), pertanto i batteri emolitici sono stati proposti come batteri indicatori sanitari per gli streptococchi dell'aria interna e lo Staphylococcus aureus. I microrganismi indicativi sanitari devono soddisfare i seguenti requisiti di base:

1. devono vivere solo nel corpo di persone o animali e si trovano costantemente nelle loro secrezioni;

2. non deve riprodursi o vivere nel suolo e nell'acqua;

3. il loro tempo di sopravvivenza e la resistenza a vari fattori dopo il rilascio dall'organismo nell'ambiente devono essere pari o superiori a quelli dei microbi patogeni;

5. i metodi per la loro rilevazione ed identificazione devono essere semplici, metodologicamente ed economicamente accessibili;

6. devono essere presenti nell'ambiente in quantità significativamente maggiori rispetto ai microrganismi patogeni;

7. Non dovrebbero esserci abitanti strettamente simili - microrganismi - nell'ambiente.

Indice Coli- il numero di Escherichia coli presenti in 1 litro (per solidi di 1 kg) dell'oggetto in studio; determinato contando le colonie di Escherichia coli cresciute su un mezzo nutritivo solido durante la semina di una certa quantità di materiale di prova, seguito da un ricalcolo per 1 litro (kg). L'indice di Coli è un valore proporzionale al contenuto effettivo di Escherichia coli nel substrato in esame.

Titolo Coli- questa è la quantità più piccola di materiale di prova in millilitri (per i solidi - in grammi), in cui è stato trovato un E. coli. Per determinare il titolo di coli, volumi decuplicati del materiale di prova vengono inoculati separatamente su terreni liquidi (ad esempio, 100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001 ml).

Per convertire il titolo di coli nell'indice di coli, dividere 1000 per il numero che esprime il titolo di coli; Per convertire l'indice coli in titolo coli, dividere 1000 per il numero che esprime l'indice coli.

33. Microflora del corpo umano in diversi periodi di età. Il ruolo dei microbi - abitanti permanenti del corpo umano nei processi fisiologici. Il concetto di disbiosi, la sua classificazione, manifestazioni e metodi di trattamento.

La microflora è localizzata solo sulla pelle e sulle mucose delle cavità comunicanti con l'ambiente esterno (ad eccezione dell'utero e della vescica). Tutti i tessuti del corpo sono normalmente completamente privi di germi.

L'automicroflora naturale del corpo è un unico complesso naturale costituito da un insieme di comunità microbiche eterogenee in varie parti del corpo umano.

Prima della nascita, il corpo umano è sterile; nell’utero, l’embrione è protetto dall’invasione microbica da parte della placenta e di altre barriere.

La microflora del tratto digestivo è la più numerosa e la più significativa per il mantenimento della salute umana. Il suo ruolo è particolarmente importante nel corpo del bambino in via di sviluppo.

Esistono due momenti critici nel processo di formazione della microbiocenosi intestinale. Il primo avviene alla nascita del bambino, quando nel primo giorno inizia la colonizzazione dell'intestino sterile, il secondo avviene quando il bambino viene svezzato dall'allattamento al seno.

Durante il parto, la pelle e le mucose del bambino entrano in contatto per la prima volta con la microflora del canale del parto della madre, con l’aria e con le mani del personale medico. Di conseguenza, la microflora intestinale dei primi giorni di vita di un bambino è rappresentata da un'associazione di aerobi (principalmente anaerobi facoltativi) - micrococchi, enterococchi, clostridi, stafilococchi. Entro il 4-5 ° giorno di vita, la composizione delle specie della microflora fecale diventa più diversificata, compaiono associazioni di anaerobi non sporigeni (bifidobatteri, propionibatteri, peptococchi, peptostreptococchi, batterioidi e fusobatteri). Tuttavia, dominano ancora i batteri aerobici: lattobacilli, cocchi e funghi di lievito.

L'ulteriore formazione dell'automicroflora del tratto gastrointestinale dipende principalmente dal tipo di alimentazione. Quando si allattano bambini sani a termine, già alla fine della prima - inizio della seconda settimana di vita, la componente anaerobica predomina chiaramente (oltre il 95%) nella comunità microbica dell'intestino crasso a causa dei tassi di crescita accelerati. La restante parte (circa 4-5%) è rappresentata da una varietà di aerobi facoltativi: lattobacilli, Escherichia, enterococchi, stafilococco epidermico, funghi lieviti.

Il ruolo dei microbi - abitanti permanenti del corpo umano nei processi fisiologici

Le biocenosi microbiche supportano le normali funzioni fisiologiche e svolgono un certo ruolo nell'immunità. I disturbi nelle biocenosi microbiche in molti casi possono portare alla comparsa di processi patologici negli organi corrispondenti.

La microflora del colon gioca un ruolo importante. Ha proprietà antagoniste pronunciate (soprattutto microbi anaerobici) e impedisce lo sviluppo di batteri patogeni che possono entrare nell'intestino con cibo e acqua, nonché batteri putrefattivi. I microbi - abitanti permanenti dell'intestino - producono batteriocine, antibiotici, acido lattico, alcoli, perossido di idrogeno, acidi grassi, che sopprimono la riproduzione delle specie patogene. Pertanto, gli anaerobi intestinali sono coinvolti nel garantire la resistenza alla colonizzazione, poiché impediscono la colonizzazione (colonizzazione) delle mucose da parte di microrganismi estranei.

I microbi intestinali partecipano anche ai processi di digestione, sale marino, proteine, carboidrati, metabolismo dei lipidi, formano un film protettivo sulla mucosa intestinale, contribuiscono alla formazione e allo sviluppo del sistema immunitario, partecipano alla neutralizzazione dei composti tossici, sintetizzano sostanze biologicamente attive (vitamine, antibiotici, batteriocine).

Di grande importanza è l'E. coli, che ha un'elevata attività enzimatica, sintetizza le vitamine B1, B2, B12, B5, K e ha proprietà antagoniste contro i rappresentanti patogeni della famiglia delle Enterobacteriaceae, contro stafilococchi e funghi p. Candida.

Il concetto di disbiosi, la sua classificazione, manifestazioni e metodi di trattamento.

Disbatteriosi(disbiosi) è una condizione che si sviluppa a causa della perdita delle normali funzioni della microflora. In questo caso, si verifica una violazione dell'equilibrio esistente tra i tipi di microbi, nonché tra loro e il corpo umano, ad es. lo stato di eubiosi è interrotto. Con la disbatteriosi si verificano cambiamenti qualitativi e quantitativi nella microflora batterica. Con la disbiosi si verificano cambiamenti tra altri microrganismi (virus, funghi). La disbatteriosi è causata da vari fattori endogeni (interni) ed esogeni (esterni). Molto spesso si sviluppa la disbiosi intestinale.

Tipo di disbatteriosi per agente patogeno:

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  stafilococco
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  Proteacee
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  lievito
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  associati (stafilococchi, proteacee, lieviti)

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  compensato: potrebbero non esserci manifestazioni cliniche;
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  sottocompensato: manifestazioni di disbiosi a volte si verificano con disturbi alimentari, ad esempio;
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  scompensato: i meccanismi adattivi sono esauriti, è difficile curare la disbiosi.